图 2 对Gli1+细胞在PDL发育过程中的动态追踪
Fig 2 Cell lineage tracing of Gli1+ cells during PDL development
左:Periostin免疫荧光染色,下图(× 630)为上图(× 200)虚线方框所对应的放大区域,其中PDL为牙周膜,D为牙本质,DP为牙髓,CC为细胞牙骨质;右上:单位面积tdTomato+细胞数,**P<0.01,***P<0.001;右下:tdTomato+细胞所占比例,**P<0.01。
2.3 Gli1+细胞对细胞牙骨质发育的作用
他莫昔芬诱导后2 d(P23),可见细胞牙骨质开始形成,而此时tdTomato+细胞主要位于牙周膜内或牙骨质表面;诱导后21 d(P42)时,可见细胞牙骨质明显膨大,tdTomato+细胞数量和所占比例增加(P<0.05),部分tdTomato+细胞分化为牙骨质细胞而包被于牙骨质基质中并表达牙骨质基质蛋白Dmp1(红色tdTomato信号与绿色Dmp1信号重叠,呈黄色);诱导后35 d(P56),tdTomato+细胞数量和所占比例进一步增加(P<0.05),占到了细胞总数的70%左右(图3)。这提示Gli1+细胞是牙骨质发育的主要细胞来源。
图 3 对Gli1+细胞在细胞牙骨质发育过程中的动态追踪
Fig3Cell lineage tracing of Gli1+ cells during cellular cementum development
左:Dmp1免疫荧光染色,下图(× 630)为上图(× 200)虚线方框所对应的放大区域,其中PDL为牙周膜,DP为牙髓,CC为细胞牙骨质;右上:单位面积tdTomato+细胞数,*P<0.05,**P<0.01;右下:tdTomato+细胞所占比例,**P<0.01,***P<0.001。
2.4 Gli1+细胞对牙槽骨发育的作用
他莫昔芬诱导后2 d(P23),tdTomato+细胞主要位于牙槽骨周围的牙周膜内,骨细胞内检测不到tdTomato的表达;随着时间的延长,Gli1+细胞来源的细胞逐渐分化成熟为骨细胞,并表达骨基质蛋白Dmp1(红色tdTomato信号与绿色Dmp1信号重叠,呈黄色),tdTomato+细胞在牙槽骨内的数量和所占比例均增加(P<0.05)(图4)。这提示Gli1+细胞是牙槽骨发育的主要细胞来源。
图 4 对Gli1+细胞在牙槽骨发育过程中的动态追踪
Fig 4Cell lineage tracing of Gli1+ cells during alveolar bone development
左:Dmp1免疫荧光染色,下图(× 630)为上图(× 200)虚线方框所对应的放大区域,其中PDL为牙周膜,AL为牙槽骨;右上:单位面积tdTomato+细胞数, **P<0.01;右下:tdTomato+细胞所占比例,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
牙源性干细胞是指一类从牙体或牙周组织中分离提取而来的成体干细胞,主要包括牙周膜干细胞、牙囊干细胞、牙髓干细胞、根尖乳头干细胞及脱落乳牙干细胞[11-14]。目前关于牙源性干细胞在牙和牙周组织发育过程中的多向分化潜能的研究主要依靠体外细胞实验,而体内的研究十分缺乏。
本研究首先通过X-gal染色分析Gli1+细胞在小鼠牙周组织内的时间和空间分布特征。由于编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因被插入到Gli1的启动子下游,使细胞表达Gli1的同时也表达β-半乳糖苷酶,通过X-gal染色后表达β-半乳糖苷酶的细胞即被染成蓝色,从而实现对Gli1+细胞的定位。实验结果显示,Gli1+细胞在牙周膜内主要分布于根尖1/3,且随小鼠年龄的增长Gli1+细胞数量逐渐减少。同时,本研究还观察到Gli1+细胞在根尖牙乳头和牙髓内也有大量分布,且随年龄的增长也呈现逐渐减少的趋势,以上实验结果与关于牙源性干细胞数量和年龄的关系的研究结论保持一致[14-15],提示Gli1可作为稳定、可靠的标志物来反映牙周组织干细胞在发育过程中表达分布的变化。
本研究还通过细胞谱系示踪技术进一步研究了Gli1+细胞在牙周组织发育中的作用。由于小鼠出生后3周时,磨牙牙根牙本质发育已基本完成,细胞牙骨质开始形成,牙槽骨和牙周膜改建较为活跃,因此本研究选择对3周龄Gli1-CreERT2/+;R26RtdTomato/+小鼠进行诱导,从而实现对牙周组织内Gli1+细胞的动态追踪。研究结果显示,Gli1+细胞在他莫昔芬诱导后2 d(P23)时分布较为局限,且细胞形态呈梭形或多角形,随着时间的延长,Gli1+细胞的子代细胞逐渐分化成熟,并参与到牙周膜、牙骨质和牙槽骨的发育中。同时这些细胞的形态也发生了变化,分别与成纤维细胞、牙骨质细胞和骨细胞形态特征相对应,并表达相应的成熟细胞的标志物(Periostin和Dmp1),证实Gli1+细胞具有多向分化的潜能。
综上,本研究证实牙周膜内Gli1+细胞是牙周组织发育的重要细胞来源。本研究可为进一步探究相关基因对牙周膜干细胞分化的调控机制奠定基础,并为牙周组织再生治疗新方法的探索提供新思路。
利益冲突声明:作者声明本文无利益冲突。
参考文献
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