1.6 Western blot实验
按蛋白试剂盒说明提取各样本的蛋白质,测蛋白浓度;以每孔50 mg蛋白作为上样标准,配胶,上样,电泳,转膜,脱脂奶粉封闭,一抗、二抗孵育,显影,分析数据。
2.1 HE染色结果及病理分级的确定
49例SD大鼠口腔颊黏膜组织通过HE染色,依据组织异常增生的严重程度,经2位高年资病理科医师读片确定:对照组7例,轻度组6例,中度组11例,重度组9例,OSCC组16例。
对照组上皮细胞结构完整,排列规则,层次清晰;轻度组的病变组织主要累及上皮层的l/3,上皮轻度增生,过角化,棘细胞层增厚;中度组的病变组织主要累及上皮层的l/3～2/3,上皮增厚较明显,基底细胞层数增加,上皮钉突伸长、变宽,部分钉突呈水滴状,细胞核浓染;重度组的病变组织超过上皮层的2/3,但尚未突破基底膜,上皮显着增生变厚,细胞核异型性、浓染,上皮钉突呈水滴状且相互融合;OSCC组主要表现为上皮层次紊乱,棘细胞层成团角化,上皮钉突增大呈滴状,基底细胞极性消失,核仁增大,核分裂象,细胞异形性明显,细胞可以突破基底膜到达固有层,固有层出现癌巢(图1)。
2.2 免疫组织化学染色实验定性确定LMO1的表达
免疫组织化学染色将LMO1表达的部位染为黄色或棕褐色,LMO1主要表达于细胞质,少量表达于细胞核和细胞膜。LMO1在正常口腔颊黏膜组织中几乎不表达,因此对照组上皮层无着色。随着口腔颊黏膜上皮异常增生程度的增加,上皮细胞细胞质逐渐被染色,且随着上皮异常增生程度的增加,上皮细胞的胞质染色越来越深,说明LMO1的表达量是逐渐增加的。此外,中度组中个别上皮细胞的细胞核核膜染为淡黄色;重度组中细胞质和细胞核核膜被染成棕褐色,细胞核染成淡黄色。而在OSCC组中,上皮细胞的细胞质、细胞核和细胞核核膜均出现棕褐色的强阳性染色反应,特别在肿瘤细胞浸润区染色更深(表1,图2)。
2.3大鼠颊黏膜中LMO1 mRNA的表达情况
随着异常增生程度的加重,LMO1 mRNA的表达逐渐增加,在OSCC组中LMO1 mRNA相对表达量最高,采用One-Way ANOVA的统计方法分析发现,对照组与轻度组间差异无统计学意义(P>0.05),其余各组组间两两比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,轻度组的mRNA相对表达量上调1.12倍,中度组上调1.38倍,重度组上调1.53倍,OSCC组上调1.76倍(图3)。
表 1 各组LMO1蛋白的阳性表达率 导出到EXCEL
组别 n LMO1的表达 阳性率/% Z值 P值
- + ++ +++
对照 7 6 1 0 0 14.3 - -
轻度 6 4 1 1 0 33.3 -0.781 0.435
中度 11 2 2 5 2 81.8 -2.836 0.005
重度 9 1 1 3 4 88.9 -3.020 0.003
OSCC 16 1 3 3 9 93.8 -3.545 0.000
2.4 大鼠颊黏膜中LMO1蛋白的表达情况
对照组和实验组中均表达LMO1蛋白,随着上皮异常增生程度的加重,LMO1蛋白的表达量逐渐增加,对照组LMO1表达量最少,OSCC组LMO1蛋白表达量最高。采用One-Way ANOVA的统计方法分析显示:与对照组相比,实验组的LMO1表达量均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。与轻度组相比,中度组、重度组和OSCC组表达均高于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05)。而在中度组、重度组和OSCC组之间LMO1表达无明显差异(P>0.05)(图4)。
图 1 SD大鼠口腔颊黏膜HE染色结果 HE × 200
Fig 1 HE staining of the oral buccal mucosa of SD rats HE × 200
A:对照组;B:轻度组;C:中度组;D:重度组;E:OSCC组。
口腔黏膜癌变过程中常出现组织细胞的侵袭转移,细胞异形性,上皮细胞可突破基底膜到达固有层并形成癌巢,随着病程的发展,癌细胞可能向周围组织发生早期转移[11-13]。本实验研究口腔颊黏膜从正常发展为OSCC这一过程中LMO1的表达变化,结果显示随着口腔黏膜异常增生程度的增加,LMO1的表达逐渐增加,提示LMO1的表达增加可能促进了肿瘤细胞的侵袭和转移,使肿瘤的发展进程加快。同样,有研究[14]表明,LMO1可能参与了EMT的调控,LMO1可与碱基序列结合蛋白GATA3结合,通过下调上皮标志物E-钙黏蛋白、角蛋白等的表达,诱导EMT的发生,使上皮细胞失去分化特征,细胞极性消失,而波形蛋白等间充质标记物的表达增加;同样在许多原发肿瘤局部浸润的早期,可以检测到EMT相关基因的表达,LMO1作为蛋白质相互作用的适配器,可能与EMT通道中的特定蛋白质形成复合体,调控相应癌变基因的转录过程,诱导细胞的异常增生和异常分化,破坏病变部位的组织结构,加快口腔黏膜癌变的进程,从而在肿瘤的发生和转移中发挥作用。增殖、分化和凋亡是细胞的基本生命活动,在机体内环境的稳定中发挥着重要作用,细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,包括分裂间期与分裂期,所有的生命活动过程都伴随着细胞的更新与凋亡,而在口腔黏膜癌变过程中,细胞凋亡发挥着重要的作用,凋亡细胞的增加可以抑制肿瘤细胞的生长,而凋亡细胞的减少则可以促进肿瘤的生长,因此,LMO1可能通过调控病变部位细胞的细胞周期活动促进口腔黏膜癌变,诱导OSCC的发生。
图 3 SD大鼠颊黏膜LMO1 mRNA的相对表达量
Fig 3 LMO1 mRNA expression level of buccal mucosa of SD rats
图 2 SD大鼠口腔颊黏膜免疫组织化学染色 SP × 400
Fig 2 Immunohistochemical staining of the oral buccal mucosa of SD rats SP × 400
A:对照组;B:轻度组;C:中度组;D:重度组;E:OSCC组。
RT-qPCR结果表明,与对照组相比,轻度组、中度组、重度组和OSCC组的mRNA相对表达量分别上调了1.12倍、1.38倍、1.53倍和1.76倍;Western blot实验中,从对照组到OSCC组,LMO1蛋白的表达量逐渐增加,而在对实验数据进行两两分析时发现轻度组与对照组间mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),其余各组组间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。同样,Western blot检测结果表明,组间两两比较发现,中度组、重度组和OSCC组间LMO1表达差异无统计学意义(P>0.05),其余各组两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。原因可能是组织从正常发展到OSCC需要先经历异常增生阶段,此过程中机体会出现免疫防御反应,不同大鼠免疫反应强度的不同也有可能导致某些阶段LMO1蛋白表达相对减少;同时,4NQO饮水法诱导组织癌变是一连续的过程,各阶段之间过渡的时间较短,病程进展较快,导致在取材时机上把握不够准确;大鼠之间的个体差异,大鼠间饮水量的差异均有可能对实验结果造成一定的影响。各实验结果提示,从正常组织诱导为OSCC这一过程中,LMO1在上皮组织中的表达量是有变化的,且变化是有规律的。
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