1.2 Y5菌株的分离
双齿围沙蚕采集自青岛近海海岸的泥沙中。将活沙蚕用无菌海水洗净后置于无菌海水中24 h使其排泄出肠道中的代谢物，解剖分离出消化道，用棉拭子蘸取内容物接种至2216E培养基，25 ℃分离培养，获得单个菌落。
1.3 形态观察
取菌株Y5接种于2216E固体培养基和营养琼脂培养基上25 ℃ 培养24 h后，光学显微镜下观察细菌形态和革兰染色反应，电子显微镜下观察细菌的结构，并测定其大小。鞭毛染色参照文献［2］方法进行。
1.4 生理特性的测定
1.4.1 生长温度
将Y5菌株接种于无菌海水配制的2216E培养基，然后分别于4、25、35、40 ℃培养，观察其生长情况。
1.4.2 耐盐性
用无菌双蒸水代替海水配制2216E液体培养基，然后加入10～130 g/L浓度的NaCl，将菌株Y5分别接种于其中，25 ℃培养24 h后观察其生长情况，以检测菌株Y5对NaCl的耐受浓度。
1.4.3 对碳源的利用及其他生化实验
参照文献［2］方法进行。
1.5 细菌脂肪酸的测定
由军事医学科学院微生物研究所采用HP 6000气相色谱仪进行测定。
1.6 DNA的（G+C）mo1％的含量的测定
采用熔点法（T 值法）测定（G+C）mol％的含量［3］。
1.7 16S rRNA基因的PCR扩增、序列测定和系统发育分析
将菌株Y5接种于LB液体培养基中过夜培养至对数生长期，用试剂盒提取基因组DNA。参照文献［4,5］的方法设计PCR扩增引物，上游引物：5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′，下游引物5′-AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′。PCR反应体系（50 μL）含：模板2.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，10×PCR缓冲液5 μL，MgCl2（25 mmol/L）5.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）5.0 μL，引物（10 μmol/L）各2.0 μL。扩增条件为：94 ℃ 6 min后，94 ℃预变性45 s、54 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s，30个循环后72 ℃延伸10 min。PCR产物经试剂盒纯化后与pGEM-T Easy载体连接，转化E．coli JM109，提取质粒后，送上海英骏生物技术有限公司测序。将实验所得的菌株Y5 16S rRNA基因1 532 bp的序列输入GenBank，与已收录的细菌基因序列进行BLAST比较。利用CLUSTAL X与其他相关细菌序列进行对比， MEGA（3.0）软件Kimura 2-parameter距离模型进行UPGMA分析生成系统发育树，发育树用Bootstrap法（重复数为1000）检验。
2 结果
2.1 形态与菌落特征
菌株Y5为革兰阴性菌，呈直杆状，大小约为（0.5～1.0）μm×（1.5～3.0）μm，鞭毛染色和电子显微镜下均未发现鞭毛（图1）；在2216E和营养琼脂培养基（30 g/L NaCl）平板上培养24 h后形成的菌落形态相似，均为圆形，凸起，边缘整齐，无色半透明，湿润有光泽的光滑型菌落，直径约0.5 mm，培养48 h后直径可达1.0～2.0 mm，淡黄色，扁平。 2.2 生理生化特征
菌株Y5可在4～40 ℃范围内生长，但4、40 ℃生长缓慢；可以在10～130 g/L NaCl环境中生长，无NaCl或浓度超过140 g/L 则不生长，表明该菌具有嗜盐性。菌株Y5可利用葡萄糖、麦芽糖，分解甘露糖的能力较弱，不能利用甘露醇、乳糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、山梨醇、棉子糖、纤维二糖、蔗糖、木糖、海藻糖、侧金盏花醇等；氧化酶、过氧化氢酶、精氨酸双水解试验阳性，不还原硝酸盐；精氨酸脱羧试验阳性，但鸟氨酸脱羧、赖氨酸脱羧阴性；另外，该菌不能液化明胶，靛基质、Tween-80水解、DNA酶、尿素酶、淀粉酶、H2S试验均阴性。见表1。表1 菌株Y5和其他海单胞菌属细菌的鉴别特征比较（略）
2.3 菌体脂肪酸含量
经气相色谱法测定，菌株Y5的主要脂肪酸成分为C18:1ω7c （41.0%）、C16:1ω7c （25.5%）、C16:0 （12.9%）、C10:0 3-OH（7.8%）。见表2。 表2 菌株Y5及相关细菌细胞主要脂肪酸组成（略）
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