2.2 转染细胞株表达产物的鉴定
免疫化学染色结果显示，pALTER?CHO不显色；而突变CD59?CHO阳性克隆的表面显棕色。Western blot 分析结果表明， 突变CD59?CHO的裂解产物中，可检出相对分子质量约为20 000的突变CD59蛋白，证实突变的CD59基因在转染的CHO 细胞中获得表达。 2.3 突变CD59的活性检测
BCECF/AM荧光染料释放试验表明，突变CD59具有补体限制性，糖基化后其活性下降（图2）。
3 讨 论
血管内皮是一个复杂的内分泌器官，它对于动脉粥样硬化的发生起到“第一道防线”的生理防御作用。内皮细胞功能异常在糖尿病血管并发症中扮演了至关重要的角色［4］。许多资料表明，糖尿病病人血管内皮及肾脏中MAC的沉积增加［５］。MAC沉积的增加可以导致从MAC靶定的内膜释放生长因子如基底成纤维生长因子和血小板源性生长因子等［6］，而生长因子的释放可以刺激血管壁细胞增殖并可导致增殖性血管并发症的发生。人CD59作为补体调节分子，可以抑制MAC的形成，从而抑制由于MAC插入内皮细胞导致的生长因子释放而导致的血管增殖性并发症的发生。但糖尿病持续高糖血症可使CD59发生非酶糖化并损伤其功能。
本文采用重叠延伸PCR和基因重组技术构建了人CD59的一种突变体，使糖基化基序K41?H44突变为K41?K42， 44位组氨酸由一无关氨基酸取代，然后稳定转染CHO细胞，从而获得突变CD59表达细胞株。根据抗原抗体复合物可激活补体从而导致靶细胞损伤的原理，对突变CD59的补体限制活性进行了初步研究。实验结果表明，突变CD59的K41?K42赖氨酸双体结构不影响突变CD59的抗补体活性，且对糖基化失活敏感，可能与糖基化位点增多有关。另外，由于细胞不能够耐受长时间的糖化，而短时间的糖化并不能够使突变CD59的抗补体活性完全丧失，因此，将来可以进一步提纯突变CD59蛋白，使其充分糖化后吸附至细胞上再做抗补体活性的检测。未来制备突变CD59单克隆抗体可以用于临床诊断，为糖尿病血管并发症诊断、预防方面提供理论依据。
【参考文献】
［1］WALSH L A, TONE M, THIRU S, et al. The CD59 antigen?α multifunctional molecule［J］. Tissue Antigens, 1992,40 (5):213?220.
［2］JUAN A, JUDITH H, RUDOLF F, et al. Molecular basis for a link between complement and the vascular complications of diabetes［J］ . Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97 (10): 5450?5455.
［3］萨姆布鲁克 J, 弗里奇 E F， 曼尼阿蒂斯 T(金冬雁译). 分子克隆实验指南［M］. 第3版. 北京：科学出版社， 2002:1109?1113, 1307?1308.
［4］李宏亮，余叶荣. 2型糖尿病患者血管内皮细胞功能异常及其机理研究［J］. 中华糖尿病杂志， 2004，12（2）：146?148.
［5］ACCARDO?PALUMBO A,TRIOLO G, COLONNA?ROMANO G, et al. Glucose?induced loss of glycosyl?phosphatidylinositol?anchored membrane regulators of complement activation (CD59, CD55) by in vitro cultured human umbilical vein endothelial cells［J］. Diabetologia, 2000,43(8):1039?1047.
［6］BENZAQUEN L R, NICHOLSON?WELLER A, HALPERIN J A. Terminal complement proteins C5b?9 release basic fibroblast growth factor and platelet?derived growth factor from endothelial cells［J］． Exp Med， 1994,179(3):985?992.
百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说医药类人CD59基因突变细胞模型的建立(3)在线全文阅读。
