人CD59基因突变细胞模型的建立(2)

    1.1.3  引物设计及合成  共设计两对引物，第一对引物用来扩增含突变位点及其上游序列的DNA片断，正向引物(FM)为：5′?AAGTGTTGGAAGAAGGAGCAGTGCAATT?3′（划线处为突变位点）；反向引物（R2）为：5′?ATTAACCCTCACTAAAGGGA?3′。第二对引物用来扩增含突变位点及其下游序列的DNA片断，反向引物（RM）为：5′?ATTGCACTGCTCCTTCTTCCAACACTTG?3′；正向引物（F2）为：5′?TAATACGACTCACTATAGGC?3′。其中FM和RM 反向互补 。以上引物由上海生物工程公司合成。
    1.2  方法
    1.2.1  重组真核表达载体的构建  在原构建的重组质粒pALTER?CD59的基础上，重新设计一对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物。通过重叠延伸PCR产生特异位点诱变［3］。将指导合成的CD59分子中的H44去掉，增加1个K42,产生突变CD59。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、纯化，并回收目的条带。将质粒pALTER及含有全长突变CD59基因的 PCR产物用EcoR Ⅰ单酶切 ,并经T4 DNA连接酶插入到pALTER质粒的EcoR Ⅰ位点，构建重组真核表达质粒（命名为mCD59?pALTER）。通过转化、筛选、酶切鉴定挑选出目的片段正向连接的重组质粒，并对筛选的克隆进行序列测定、分析（由上海生物工程公司协助完成）。
    1.2.2  细胞转染及筛选  重组质粒mCD59?pALTER对CHO细胞的转染，参照Lipofectamine 2000的说明书进行。以质粒突变CD59?pALTER 与pcDNA3共转染CHO细胞，同时设不带突变CD59基因的空pALTER转染CHO细胞作为阴性对照。转染后24 h， 将细胞作1∶10稀释后传代，在含800 mg/L G418的RPMI 1640中培养约2周后，出现阳性克隆。挑取单个克隆，继续抗性筛选2周，其阳性克隆的后续培养始终在G418维持剂量（400 mg/L）下进行。经连续传代10次后，收集细胞，对表达产物进行鉴定。
    1.2.3  克隆细胞株表达产物的鉴定  采用免疫化学染色方法：收集细胞，用PBS洗3次，涂片、乙醇固定后晾干。灭活内源性过氧化物酶后，依次与羊抗人CD59 多克隆抗体、HRP?兔抗山羊IgG于37 ℃作用各45 min，最后以DAB底物显色后镜下观察。 收集细胞，经裂解处理后，离心收集上清进行Western blot 分析，将不同相对分子质量蛋白质分离并进行特定条带酶免疫染色，进一步确定CD59分子的表达。
    1.2.4  荧光染料释放试验  用BCECF/AM荧光染料渗入法，测定突变CD59蛋白糖基化前后的抗补体活性。将细胞接种于96孔板内，每孔1×104个细胞。在接种突变CD59?CHO的孔中，半数孔中加入核糖（终浓度为50 mmol/L）作为实验组，另一半孔不加核糖作为对照组。培养72 h后，加入氰基硼氢化钠以稳定加合物并维持细胞体积及膜电位不变。然后置于37 ℃孵育20 min，洗涤后每孔加入BCECF/AM（终浓度为2 mg/L），再于37 ℃孵育30 min使其渗入细胞内部。然后每孔加入自制的抗CHO细胞多克隆抗体（1∶1 000稀释）50 mL，置37 ℃水浴中30 min。洗涤后，加入不同浓度（1∶1、1∶2、1∶４、1∶8）的新鲜人血清（含补体），每孔100 μL，于37 ℃作用15～20 min。吸出上清，加入到2 mL PBS液中，测定其荧光强度（FI）。最后于每孔中加入100 μL的细胞裂解液，以释放出细胞内部的BCECF/AM，并测定荧光强度（FI）。所用激发波长为500 nm，发射波长为530 nm。荧光释放率的计算公式为：染料释放率（%）=上清中染料释放的FI值/（上清中染料释放的FI值+细胞裂解后染料释放的FI值 ）×100% 。
    2  结    果
    2.1  重组质粒的鉴定 
    以EcoR Ⅰ对突变CD59?CHO进行酶切，可获得1条496 bp的电泳带，与所插入的片段的大小相一致（图1）。测序结果表明，突变CD59?pALTER质粒含有突变的CD59全长cDNA序列。

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