1.2.3 重组质粒pEF?fat?1的序列测定 将酶切鉴定为阳性重组子的pEF?fat?1送交北京三博远志生物公司进行全自动序列测定。
1.2.4 转基因小鼠的获得 pEF?fat?1经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切后，8 g/L琼脂糖凝胶电泳分离回收 5.5 kb的大片段，纯化，最后溶解于微注射缓冲液（内含10 mmol/L Tris HCl ，pH 8.0，0.1 mmol/L EDTA）中，并准确调整DNA至 3 mg/L，以3 pL的量注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中。小鼠为清洁级昆明白小鼠。
1.2.5 转基因小鼠的整合检测 提取4～6周龄G0代转基因小鼠尾尖DNA，用PCR法测定G0代转基因动物的整合情况。所用引物为:上游5′?GTAGCCT TGCAGAAGT TGGTCG?3′；下游5′?GACG G AAAGCATCCACAGTTGG?3′。 扩增条件为：94 ℃、3 min,94 ℃、40 s,55 ℃、40 s ，72 ℃、1 min,72 ℃、8 min,30个循环, 扩增出的片段大小为440 bp。经PCR检测阳性的小鼠再经Southern blot杂交做进一步确定。探针为pEF?fat?1，经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切获得。
1.2.6 转基因小鼠的饲养和繁育 小鼠的饲养条件为清洁级。将G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生G1代小鼠。根据遗传规律，鉴定至第5代时将得到稳定遗传的转基因小鼠。
2 结 果
2.1 重组质粒pEF?fat?1的酶切鉴定及DNA序列测定
重组质粒分别经EcoRⅠ/XbaⅠ、 BgⅢ、XhoⅠ酶切鉴定，结果与原来载体和目的基因所带的限制性酶切位点相符。见图1。重组质粒pEF?fat?1的测序结果表明，载体与 fat?1 cDNA接头部分及fat?1 cDNA本身序列均正确，无碱基突变。
2.2 转基因小鼠的获得
将pEF?fat?1经SpeⅠ/BamHⅠ双酶切后回收纯化的片段显微注射到小鼠受精卵的雄原核中。共注射并移植受精卵738枚，存活的受精卵为486枚，将存活的受精卵移植到假母，成活的假母数为48只，最后生下42只G0代小鼠。
2.3 PCR检测阳性G0代小鼠
以上述42只G0代鼠尾DNA为模板，作PCR检测，共检测出阳性小鼠11只。部分结果见图2。
2.4 Southern blot检测阳性G0代小鼠
取PCR阳性样品作Southern blot杂交，结果显示有4只G0代小鼠基因组中整合有目的基因。见图3。将此阳性整合有外源基因的G0代转基因小鼠与正常小鼠交配产生G1代小鼠。
3 讨 论
许多研究发现， n?6 PUFAs可促进动物肿瘤的生长，而n?3 PUFAs则能抑制动物肿瘤的生长。临床研究显示，给乳癌和直肠癌病人的饮食中添加n?3 PUFAs，可减轻或抑制肿瘤的发展［8,9］。补充n?3 PUFAs对炎症和自身免疫病，如关节炎，具有治疗效果［10］。因此,n?3 PUFAs已日益成为研究的热点，人们更加注意到它作为药物和营养类化合物的价值。 另一些研究表明,对于维持细胞的稳态和正常生长起关键作用的是n?6/n?3 PUFAs的比例，而不是两者的绝对值［11］。仅仅通过饮食摄取足量的n?3 PUFAs的效率很低，很难满足机体的需要，这使得在哺乳动物体内迅速增加n?3 PUFAs非常困难。
n?3 PUFAs或n?6 PUFAs的合成是分别通过对亚油酸（LA）或 ?亚麻酸(ALA)进行一系列脱氢和延长来完成的。动物细胞缺乏脱氢酶活性，n?6和n?3 PUFAs也不可相互转化。所以，ALA及对应的延长产物（n?3 PUFAs）就成为人类的必需脂肪酸。但是，一些植物和微生物具有能合成n?3脂肪酸ALA的基因，如fat?1。该基因来源于小秀丽线虫，mRNA全长1.4 kb，其功能可将n?6 PUFAs脱氢转化成相应的n?3 PUFAs。当把该基因在植物阿拉伯芥中进行表达时，通过把n?3双键引入到n?6 PUFAs碳氢链中，能催化n?6 PUFAs转化成为n?3 PUFAs［1］。
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