威灵仙类药材中多糖含量的比较(2)

　　2.2  精制多糖的鉴别取混合多糖2 mg，用蒸馏水10 ml溶解后精密吸取1 ml至具塞试管中，加入1 ml α-萘酚溶液，混匀后沿试管壁加入浓硫酸溶液1 ml，静置观察。实验结果表明，液面交界处有混合多糖紫红色环状阳性反应。

　　2.3  标准溶液的配制精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖15.57 mg，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.155 7 mg/ml的标准溶液。

　　2.4   5%苯酚溶液的配制 取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，常压蒸馏，收集182 ℃馏分。精密称取该馏分13.001 2 g，置于250  ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀后滤过至棕色试剂瓶中，放冰箱备用。

　　2.5  测定波长的选择精密吸取0.155 7 mg/ml葡萄糖溶液和样品溶液各1.0 ml，置10 ml具塞试管中，加入5%苯酚溶液1.0 ml，混匀，迅速加入浓硫酸5.0 ml，摇匀后放置5 min，置60 ℃水浴中加热20 min，取出置冷水中冷却至室温，以相应的试剂为空白，在400～800 nm进行扫描，在487 nm有最大吸收。

　　2.6  标准曲线的制作精密吸取上述标准品溶液0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 ml于10 ml具塞试管中，分别用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀。另取1.0 ml蒸馏水作空白对照。各管再加入1.0 ml的苯酚溶液，混匀，迅速加入浓H2SO4 5.0 ml，摇匀后放置5 min，置60 ℃水浴中加热20 min，取出置冷水中冷却至室温，于487 nm处测定吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线，经过计算得回归方程：

    C=13.195A+0.180 5，r=0.999 9，葡萄糖量在7.785～62.28 μg范围内与吸光度呈良好的线性关系。

　　2.7   换算因子的测定取60℃干燥至恒重的精制混合多糖约10 mg，精密称定，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀作贮备液。精密吸取贮备液0.5 ml用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀。同标准曲线项下方法测定吸光度，由回归方程中求出3种药材的混合多糖溶液中葡萄糖浓度，按下式计算，测得平均换算因子f=1.677。

    换算因素f= W/(C·D)

    式中：W为混合多糖的重量(mg)；C为多糖贮备液中葡萄糖浓度(mg/ml)；D为多糖的稀释因素（ml）。

　　2.8   样品溶液的制备取各药材粗粉约0.5 g（过40目筛）置三角烧瓶中，精密称定，加入40 ml 80%乙醇，90℃回流提取1 h，趁热过滤，药渣用80%热乙醇洗涤(10 ml×3)后，挥干溶剂。药渣连同滤纸置烧瓶中，加蒸馏水50 ml置沸水温浸提取1 h，趁热过滤，药渣用热水洗涤(10 ml×3)，洗液并入滤液中，置冷后，转移至100 ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。

　　2.9   精密度实验精密取柱果铁线莲样品溶液（贵阳三桥）0.7 ml，于10 ml具塞试管中，分别用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀。按标准曲线项下方法操作，在487 nm处重复测定6次吸光度，计算，得RSD =0.61%，表明仪器精密度良好。

　　2.10   稳定性实验准确吸取同一样品溶液0.7 ml于10 ml具塞试管中， 用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀，按照标准曲线项下方法制备完成后1 h内测定吸光度(A)，每隔10 min测定1次，考察其稳定性。其RSD=1.47%，样品溶液在1 h内稳定。

　　2.11   重复性实验取柱果铁线莲样品（贵阳三桥）约0.5 g，精密称定。按“2.8”项下方法操作，同时制备6份样品溶液。准确移取样品溶液0.7 ml，置于具塞试管中， 用蒸馏水补至1.0 ml，摇匀，按照标准曲线项下方法测定吸光度(A)，计算柱果铁线莲药材中多糖的平均含量为2.145%，其RSD =1.21%，表明含量测定方法的重复性良好。

　　2.12  回收率实验精密称取0.25 g已知含量的柱果铁线莲药材粗粉（贵阳三桥）9份，均分成3组，分别加入4，5，6 ml的1.076 8 mg/ml精制混合多糖溶液，混匀后，按标准曲线项下方法测定含量，计算加样回收率。平均回收率为100.30%，RSD  =1.54%（n=9，已乘换算因素）。结果见表1。表1  加样回收率测定结果（略） 

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