不同提取方法赶黄草提取物清除DPPH自由基的作用研究(2)

    二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)，购自sigma公司。

    供试药材赶黄草2007-10下旬采自湖南浏阳，由湖南中医药大学周日宝教授鉴定为虎耳草科植物赶黄草Penthorum chinense Pursh。

　　2  方法

　　2.1  赶黄草有效成分的提取

　　2.1.1  回流提取法准确称取药材10.0 g，加入10倍量的溶剂，回流提取2 h，重复两次，将提取液过滤，滤液真空浓缩至浸膏，干燥待用。

　　2.1.2  超声提取法准确称取药材10.0 g，加入10倍量的溶剂，加热超声2 h，重复两次，将提取液过滤，滤液真空浓缩至浸膏，干燥待用。

　　2.1.3  温浸法准确称取药材10.0 g，加入10倍量的溶剂，温浸2 h，重复两次，将提取液过滤，滤液真空浓缩至浸膏，干燥待用。

　　2.1.4  不同极性溶剂萃取法准确称取药材50.0 g，以“2.1.1”方法用75 %乙醇提取两次，提取液经真空浓缩至小体积，依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，所得各萃取部分浓缩成浸膏，干燥待用。

　　2.2  赶黄草提取物清除DPPH自由基能力的测定

　　2.2.1  清除率的测定精密称取8.0 mg DPPH于50 ml容量瓶中，用95 %乙醇溶解；样品溶解于95 %乙醇溶液中。取样品溶液1 ml加入到离心管，再加入3 ml的DPPH溶液配成样品溶液。95 %乙醇溶液1 ml加入到离心管，再加入DPPH溶液3 ml配成未加样品液的DPPH溶液。取样品溶液1 ml加入到离心管，再加入3 ml的95 %乙醇配成样品空白溶液。上述溶液在室温下离心20 min后用紫外分光光度计在517 nm下检测。测定样品溶液吸光度Ai，未加样品液的DPPH溶液吸光度Ac，样品空白溶液吸光度Aj。根据下列公式计算清除率：

    清除率=［1－（Ai－Aj）／Ac］×100%

　　2.2.2  半清除率的测定抗氧化剂清除自由基能力采用清除DPPH的半清除率（IC50值）表示。将待测液配制成不同浓度溶液，测定DPPH自由基清除率，并绘制DPPH自由基清除率对待测液浓度曲线，由曲线读取或用方程计算出DPPH自由基清除率为50 ％时所需赶黄草提取液浓度，计算出赶黄草提取液中溶质质量，按公式计算IC50值。溶质质量所需浓度越低，表明半清除率越高。

    IC50=50％×消耗的DPPH质量／加入的试样溶液中溶质的质量

　　3  结果

　　3.1  DPPH吸收光谱与测定波长的确定 DPPH在溶液中具有典型紫红色，当它与能提供1个电子的自由基清除剂作用时，生成浅色产物，使溶液的典型紫红色变浅。测定DPPH溶液在200～600 nm之间的光谱图，由图1可知，DPPH溶液在醇-水体系中其327 nm和517 nm处吸光度都具有极大值，但517 nm处的极大值在加入槲皮素后降低较显著，故选用在95%乙醇体系下517 nm处DPPH含量的变化来进行测定。

　　3.2  DPPH溶液稳定性实验测定DPPH在95 %乙醇中吸光度变化与时间的关系，结果显示DPPH的吸光度在40 min内基本不变。加入样品后，测定吸光度与时间的关系，发现吸光度随时间增长呈线性降低，但30 min后，吸光度的变化已经很小。结果见图2。为了提高测试准确度，在加入样品反应20 min后，迅速测定吸光度。
　
　　3.3  抗氧化剂浓度与其清除DPPH的关系抗坏血酸、没食子酸和槲皮素是常见的抗氧化剂［6］，配制槲皮素、抗坏血酸、没食子酸标准溶液，逐级稀释使用。按“2.2.1”方法测定，图3可见抗氧化剂浓度在一定范围内，随着浓度的增高，清除DPPH自由基的能力逐渐增大。各抗氧化剂浓度与清除率之间线性方程分别表示如下，槲皮素：Y=1.273 6×103C+5.715 7，R2=0.995 9；没食子酸：Y=0.967 1×103C+9.561 4，R2=0.986 0；抗坏血酸：Y=1.073 6×103C+3.981 4，R2=0.985 5。可见，在一定范围里，可以用清除率来表示抗氧化剂SPPH自由基的清除能力。

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