基于1H NMR 代谢组学的阳明经穴特异性研究(2)

　　2.3模式识别分析将保存的Excel格式数据输入到SIMCA-P+软件(v10.04，Umetrics，Ume?，Sweden)进行模式识别分析。数据采用Pareto标度化(Pareto scaling)进行预处理之后;再采用正交信号校正(OSC，orthogonal signal correction)滤噪，然后再进行PCA和PLS-DA分析。分析结果以得分图(scores plot)和载荷图(loadings plot)的形式表示。

　　3结果

　　3.1针刺阳明经穴对机体尿液代谢的影响分别针刺足三里，梁门和巨髎后机体尿液代谢物的改变如图1a所示。结果显示3个组在得分图上均分布于PC1的2SD范围内，即各组经模式识别后分离趋势不明显。表明针刺这3个穴位对机体的尿液代谢影响效果较为一致。但与空白对照组相比，针刺阳明经穴后尿液代谢物明显不同(图1b)，模式识别后与空白对照组分布于不同区域，阳明经穴各组主要分布于得分图的PC2正方向，而空白对照组主要分布于PC2负方向。对应的因子载荷图(图1c)显示，针刺阳明经穴可以明显升高尿液中肌酐(δ 3.06,4.06)，马尿酸(δ 7.82，4.06)和羟基丁酸(δ 3.98)的含量，降低甘氨酸(δ 3.58)的含量。足三里组 (■)、梁丘组(●)、巨髎组(◆)与空白对照组(?)图1针刺阳明经穴位后血浆代谢物模式识别结果

　　3.2针刺阳明经穴与针刺阳陵泉对机体尿液代谢的影响针刺阳明经穴与针刺阳陵泉穴后机体尿液代谢物经模式识别分析后显示，各组有差别，但差别不明显，表现为在得分图上聚类分布的趋势较不明显，提示针刺阳明经穴与针刺阳陵泉对机体尿液代谢的影响似乎差别不大。足三里组 (■)、梁丘组(●)、巨髎组(◆)与阳陵泉组(▲)图2针刺阳明经穴位与阳陵泉后尿液代谢物的比较结果

　　3.3针刺阳明经穴与针刺委中对机体尿液代谢的影响比较针刺阳明经穴与针刺委中之后机体尿液代谢改变的异同可以看出，针刺委中组在得分图上主要分布于左上方，成聚类分布的趋势，与阳明经各组分布范围明显不同(图3a)。对应的因子载荷图(图3b)显示，造成委中组与其它各组差别的主要物质是肌酐(δ3.06，4.06)明显升高，而针刺阳明经穴主要表现在尿液中马尿酸(δ 7.82，4.06)和氧化三甲胺(δ 3.26、δ 7.54)的升高。

　　4讨论

　　经穴特异性理论一直是针灸研究中的热点问题[1，2]。多年来，研究者采用传统研究手段与X射线荧光分析(Protonbeam Induced X -Raye Mission，PIXE)、激光多普勒、红外辐射检测等多种现代技术相结合的方法对经穴特异性进行了评价和研究，在经穴形态结构[3]、生物物理特性[4]、经穴效应特异性[5～7]、经穴(经脉)一脏腑相关理论等方面作了大量的临床与基础研究，取得了一系列的研究成果。我们认为，经穴特异性是一种相对特异性，具有生物物理特异性，时间动态特异性，空间特异性，脏腑相关特异性等多种表现形式，但最终的体现和结局应该是经穴效应的特异性[8,9]。另一方面，机体作为一个复杂的整体系统，外界刺激的扰动会干扰内源性生化物质的浓度、比例、结合或流量。针灸刺激对机体的作用具有良性、整体和综合调整的特点，是能量、物质和信息流动的综合体现，针灸刺激影响整个机体的有效功能很可能通过代谢物反映出来，通过对代谢物的检测和分析，采用数学、物理学、信息学等多种研究方法，深入挖掘所得数据的规律性，从复杂的数据中最大限度地提取信息，很可能深入认识针灸刺激对机体内部物质和信息的扰动过程以及机体对针灸刺激的应答模式[10]。代谢组学是继基因组学、蛋白质组学等之后发展起来的又一组学技术，它通过生物体液和组织来对完整的生物体(而不是单个细胞)中随时间改变的代谢物进行定量分析;能够全面研究机体新陈代谢活动链上的终产物的变化，然后将这些多维代谢轨迹与病理生理过程中的生物学事件联系起来，反映生物体系的状态[11～13]，这与传统中医有异曲同工之处[14,15]。用代谢组学方法来研究中医理论和中医药，有可能成为中国传统医学走向国际化的通用语言[16]。近年来代谢组学技术在中医学研究中的作用越来越受到重视，并分别在中药的作用机制与毒理、疗效与安全性评价、质量控制，中医证候的本质等方面进行了大胆的尝试。针灸学作为中医药理论的一部分，采用代谢组学研究针灸基本理论和作用规律，有望为针灸的治疗效应提供更新、更符合机体实际情况的证据，为针灸基础研究提供新的思路和方法。模式识别是把具体事物进行正确归类的科学，其内涵可以概括为信息处理、分析与决策，它可以对1H NMR所得的代谢物数据进行分类识别，并结合其对应的因子载荷图(loading plots)和代谢谱峰寻找关键代谢物或生物标志物，通过挖掘这些关键代谢物或小分子生物标志物的代谢意义，就能明确外界刺激对机体影响的“代谢组学特征”和生物意义。有研究表明，由于在NMR数据分析中结合应用了模式识别，使得代谢组学的的研究结果比基因芯片、蛋白芯片等得到的结果更为精确(代谢组学达到了96%以上的精确度)[17]。足三里组 (■)、梁丘组(●)、巨髎组(◆)与委中组(?)图3针刺阳明经穴位与委中后尿液代谢物的比较结果本研究发现，尽管针刺不同穴位后血浆代谢物各不相同，但通过模式识别分析不难发现，针刺“足三里”，“梁门”，“巨髎”后血浆代谢物呈簇类分布或有共同变化的趋势，说明针刺这三个穴位对机体尿液代谢的干扰基本相似，这与血液研究的结果类似。但是，针刺“阳陵泉”后机体尿液代谢与针刺阳明经穴相比变化不明显，这与血液研究的结果显著不同，我们在前期血液研究中发现，针刺“阳陵泉”后与针刺阳明经穴机体血浆代谢物明显不同，模式识别后能显著分开，为阳明经与阳陵泉的区别提供了证据，但本次对尿液的研究却显示针刺阳明经穴与针刺阳陵泉之间的区别并不显著，其具体机制和原因有待深入研究。与血液研究结果类似的是，模式识别能明显将委中组与阳明经穴组分开，即可以初步判断委中不属于阳明经。从具体代谢物来看，针刺委中后尿液代谢物中肌酐明显升高，而针刺阳明经穴主要表现在尿液中马尿酸和氧化三甲胺的升高。肌酐为人体肌酸代谢的终产物，后者为人体的生理活动提供能量，正常情况下，肌酐的含量变化与人体的运动密切相关。委中是治疗腰背痛、下肢痛等的主要穴位，与人体运动系统的功能密切相关，这是否提示针刺委中能够提高机体对能量的利用度?或者增加机体对能量物质的摄取?马尿酸是人和肠道菌群共同的代谢物，单纯人体的胃肠道细胞代谢不会形成马尿酸，本研究的结果提示针刺阳明经穴可能通过调节胃肠道中肠道菌群的数量或者功能发挥改善胃肠道功能的作用。但针刺这些不同的穴位是通过何种途径调节这些尿液代谢物的，其进一步的生理意义是什么，这些问题都亟待进一步研究。

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