耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究(2)

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1标本来源实验用的31株MRSA标本来源于2007年3月至2007年12月间西安交通大学医学院第一、第二附属医院的住院患者。

　　1.1.2实验仪器及试剂MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析;药敏试验纸片购自英国OXOID公司，Mueller-Hinton平板由本实验室自行配置;细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、PCR试剂2×Taq PCR MasterMix(含染料)、DNA Marker Ⅱ均购自北京TIANGEN生物技术有限公司;溶菌酶(活力单位>2000u/mg)、蛋白酶K购自Amrescos生物公司;金黄色葡萄球菌mecA基因PCR检测引物和HVR-PCR、RAPD多态性分析引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。DNA扩增仪为MJ Research Inc公司的PTC-200 PCR仪;稳压稳流电泳仪为美国Bio-RAD公司产品;ZF紫外分析仪购自上海小源科技有限公司。

　　1.2方法

　　1.2.1细菌鉴定用MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析仪鉴定MRSA，同时用PCR检测mecA基因，凡头孢西丁(FOX，30μg)纸片药敏试验≤19mm的金黄色葡萄球菌，且mecA基因阳性者报甲氧西林耐药，即为MRSA。

　　1.2.2PCR引物根据GenBank中金黄色葡萄球菌MRSA基因序列选取适用引物：HVR引物序列为，P1：5′-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3′，P2：5′-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3′[1]，RAPD引物序列为，EP007：5′-AGCACGCTGTCAATCATGTA-3′[2]，KAY1：5′-AGCAGCCTGC-3′[2]。

　　1.2.3细菌DNA的提取按北京TIANGEN公司生产的细菌基因提取试剂盒(DP302)步骤，提取葡萄球菌基因组DNA。

　　1.2.4MRSA的HVR-PCR分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系：HVR P1和P2引物各1μL(引物浓度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水ddH2O 9.5μL，反应总体积为25μL。PCR反应条件：94℃预变性5min;94℃ 60s，56℃ 45s，72℃，60s，35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后分析结果。

　　1.2.5MRSA的RAPD分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系：RAPD引物EP007 1μL(引物浓度10μmol/L)，RAPD引物KAY1 1μL(引物浓度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水ddH2O 9.5μL，反应总体积为25μL。PCR反应条件：94℃预变性2min;94℃ 45s，34℃ 45s，72℃，60s，35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中进行成像分析。

　　2结果

　　2.1MRSA的HVR-PCR分型结果应用HVR-PCR方法对31株MRSA标本进行分型，一共可以分为7型，分别含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs。所有的MRSA都可以扩增出长度450～820bp的基因片段，用HVR-PCR分型方法都可以加以区分，分型率达到了100%。DRUs的数目=(扩增的基因片段长度-171)/40，其中171是存在于扩增序列之中而没有重复的序列片段长度，40是每一个正向重复单元序列的长度。所有MRSA菌株中，10DRUs型最多(11/31，35.48%)，其次是9DRUs型(8/31，25.81%)，11DRUs型(4/31，12.90%)，7DRUs型(3/31，9.68%)，12DRUs型(2/31，6.45%)，8DRUs型(2/31，6.45%)，最少的是16DRUs型(1/31，3.23%)。结果见图1、表1。

　　2.2MRSA的RAPD分型结果

　　2.2.1RAPD的电泳结果31株MRSA经过RAPD两条引物混合扩增分型，均可得到数量不等、位置不同的扩增条带，条带数目在1～6条之间，分型率达100%(图2)。图1MRSA的HVR-PCR电泳图Fig.1 The electrophoresis result of HVR-PCR of MRSAM：100bp ladder DNA Marker;1、3、6、10： PCR产物长531bp，9DRUs型;2、7：PCR产物长571bp，10DRUs型;4、9：PCR产物长611bp，11DRUs型;5、8：PCR产物长651bp，12DRUs型。表1HVR-PCR的分型结果

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说医药类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究(2)在线全文阅读。