研究生分子生物学实验讲义(7)

提示

－、 常见问题:

1. 非重组子多（即蓝斑数多）：载体消化不完全，和插入片段太少导致载体自连。 2. 没有转化子(假设感受态细菌很好)：太多或太少载体－插入片段复合体；连接酶缓冲液有问题（通常是ATP）；连接酶有问题。

3．PCR产物难以插入载体：确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3’端加了―A‖，有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端，如TaKaRa公司的Pyrobest DNA聚合酶等；PCR产物中短片段杂质DNA太多，应切胶纯化DNA片段；确认感受态细菌的质量。 二、 注意事项：

1．在进行克隆时，载体DNA与插入DNA的摩尔比一般为1：2～10。在TaKaRa公司的pMD18-T载体试剂盒中，1μl（50ng）载体的摩尔数约为0.03pmol, 对照插入DNA 1μl (50ng)的摩尔数约为0.15pmol。

2．克隆时使用的插入片段（PCR产物）尽量进行切胶回收纯化，PCR产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质、DNA片段的立体结构、片段的长度等都会影响TA克隆的效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率小于短片段DNA。

3．本实验操作连接后，直接进行转化时连接液的体积不要超过20μl。 4．连接反应应在16℃以下进行，温度升高（大于26℃）较难形成环状DNA。 5．连接效率偏低时，可适当延长连接时间至数小时。

6．当进行转化DNA用量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀精制DNA后再进行转化。

7．T载体应一直保存在－20℃。当以干粉状态保存时，则可以保存更长时间。

附： pMD 18－T Vector连接试剂盒使用说明（TaKaRa公司）

1． 微型离心管中加入下列连接反应液， 反应体系 ① pMD 18－T Vevtor 1μl PCR扩增产物 1μl

Control Insert DNA 1μl ddH2O 3μl 3μl Solution I 5μl 总体积 10μl

5μl 10μl ② 1μl

（注：在连接单一外源DNA片段时，T载体取0.5μl实验也可得到满意的效果）

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2． 用微量进样器加样，顺序为ddH2O， T 载体，PCR产物，最后加Solution I（放于冰浴中）。用后立即放回－20℃保存。

3． 盖紧盖子用手指轻弹Eppendorf管或用微量进样器混匀反应液，于台式离心机转2秒钟，以集中样品。

4． 将各反应管置温度已调至16℃的保温瓶内，盖紧瓶盖，反应30分钟以上（过夜反应不一不能影响效果）。

5． 各管取约25ng的DNA连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接反应效果，电泳时需以载体酶切片段、目的基因酶切片段作为对照。

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实验九：重组DNA转化

目的：在体外连接组装而成的重组DNA分子只能转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。通过实验学会重组DNA转化的最基本的操作以及如何提高转化效率的基本思路。

原理：带有外源DNA片段的重组体分子在体外构建成后，需要导入适当的宿主细胞内进行繁殖或表达出具有一定生物活性的蛋白。能够作为重组体转化的受体，主要有动物细胞、植物细胞、微生物细胞等。导入受体细胞的途径主要有转化（转染），显微注射和电穿孔等多种不同的方式。可以根据不同的受体选择不同的导入方式。一般情况下，细菌一类的原核生物和酵母这样的低等真核细胞可用转化方式导入，而高等动植物细胞则需采用显微注射或电穿孔来进行。

细菌表面通过CaCl2处理后，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，DNA分子能够通过质膜进入细胞。其进入细胞的方式是完整的双链DNA分子首先吸附到细胞表面，双链DNA分子解链变成单链，单链DNA分子一条进入受体细胞内，另一条被降解。进入细胞内的单链DNA则复制成双链环状DNA，随同复制子同时复制，并被转录翻译。

仪器与主要试剂：

（一） 仪器

1． 隔水式电热恒温培养箱 2． 超净工作台 3． 高速冷冻离心机 4． 水浴锅 （二）主要试剂

1． LB液体培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，用5mol/L NaOH

调节PH值至7.4，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。

2． LB固体培养基：在配制的液体培养基三角烧瓶中加入2%琼脂，于

103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。 3． 抗菌素：

（1） （2）

氨苄青霉素(Amp)用前在无菌试管中,用灭菌水配制,母液浓度链霉素（Str）用前在无菌试管中, 用灭菌水配制,母液浓度为

为100mg/ml。 50mg/ml。

4． 100mmol/L CaCl2 溶液：称取无水CaCl25.6克，加重蒸水至500 毫升，

于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。

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5． 50%的PEG6000溶液：称取50 克聚乙二醇6000加重蒸水溶解，定容

至100毫升，103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。

实验方法（用CaCl2制备新鲜的感受态细胞转化法）：

感受态细菌制备

（1） 挑取平板上活化菌落接种于2毫升LB培养液中，37C培养过夜。 （2） 按1%挑取过夜培养菌接种于50mlLB培养液中，370C振荡培养2～

2个半期小时（OD600约在0.2～0.4） 。

（3） 培养物放冰浴中冷却10分钟。

（4） 分装在离心管中，4C 5000rpm离心5min，收集菌体，培养液尽量

倒干净。

（5） 把菌体悬浮于10 ml的100mmol/L CaCl2 溶液，置冰浴中20min，

40C5000rpm离心5min，收集菌体。

（6） 再将菌体悬浮于1-2ml的100mmol/L CaCl2 溶液中，40C保存，12-24

小时后即可作为感受态细胞进行转化。

转化实验

（7） 取200?l感受态菌，加入待转化的重组DNA（体积应小于10?l，

DNA?50 ng）混匀后置冰浴中30min（一般同时要做阳性对照和阴性对照。阳性对照为加入已知量的未重组质粒DNA的感受态菌，用于检测转化效率。阴性对照为完全不加质粒DNA的的感受态菌，用于检测感受态细菌有无污染及检测抗生素的活性）。

（8） 放入冰浴中30 min，转入420C水浴90s，再冰浴1-2 min，加入培养

液800?l，放370C振荡培养45min。

（9） 将适当体积已转化的感受态细胞均匀铺于含有X-gal和IPTG的琼脂

平皿上。

（10） 待平皿中液体吸收后，倒置平皿，于370C培养12-16小时可出现菌

落。根据兰白斑进行重组子的筛选。

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实验十：重组子的鉴定

目的：从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。了解重组子鉴定常用的几种方法及其原理，掌握其中一、两种鉴定方法的操作步骤。 原理：不同的克隆载体及相应宿主系统，其重组子的筛选和鉴定方法不尽相同。根据重组子遗传表型改变进行筛选，有?-互补、插入灭活等方法；根据重组子结构来筛选，方法有限制酶切分析、PCR法以及杂交筛选等。通过这些方法的鉴定，我们可以确定是否在载体中插入了外源DNA，但是，如果该DNA片段来源于PCR扩增，或经突变改造后的产物，还要最终通过DNA序列分析，进行确定其是否与我们所要研究的目的基因的序列完全一致。 A． ?-互补法

现在使用的许多载体（如PUC系列）都带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有?-半乳糖苷酶基因lacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框，但可使小数几个氨基酸插入到?-半乳糖苷酶的氨基端。这种载体适用于可编码?-半乳糖苷酶碳端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶性，但它们可融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的?-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补，这种现象叫?-互补。有?-互补产生的Lac+细菌易于识别，因为它们在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-?-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落。然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，破坏了原有的阅读框，即产生无?-互补能力的氨基酸片段。因此，在相同条件下，带重组质粒的细菌形成白色菌落。 B．插入失活法

该法只能用于比较老的质粒（如PBR322），这些载体带有两个或更多个抗生素抗性基因和分布适宜的限制性酶切位点。待插入的DNA及已纯化的质粒DNA都用限制酶消化，这些酶的识别位点只位于一个抗生素抗性基因区内（terr）。在适宜温度下将两个DNA连接后，用连接产物转化大肠杆菌，选择对第二个抗生素(氨苄青霉素)有抗性的转化体。在氨苄青霉素存在下生长的菌落，一些含有重组质粒，而另一些可能含有无外源DNA而在连接过程中自身环化的质粒DNA。为区分两种转化体，可以用两种分别含有氨苄青霉素和四环素的平板，在相互对应的位置上，各自接入同一菌落，照此将一批菌落接种于平板的各处。在四环素平板中存活并生长的菌落含有带活性ter基因的质粒，这样的质粒不可能有外源DNA插入。在四环素平皿中不生长而在氨苄青霉素平板中生长的菌落含有带失活的terr基因的质粒，这些质粒可能带有外源DNA序列。

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