研究生分子生物学实验讲义(4)

实验五：酶切产物的鉴定

目的：对所克隆的目的基因片段进行鉴定。在基因工程操作过程中，经常需要所克隆目的片段进行鉴定，常用的方法有：PCR扩增技术、限制性内切酶酶解反应等。这里简单介绍一下酶切产物的鉴定。

原理：酶切产物的鉴定通常采用在下列情况：①当获得友人所赠的含有目的基因时，通常根据原作者所提供的酶切图谱采用此法进行鉴定（图1）。②当自己克隆目的基因片段或亚克隆到另一载体上的时候亦可用此法（原理同图1）。③选择适当的内切酶鉴定基因在表达载体上是正义或反义连接（图2）。

该法可按酶解产物分子量的大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子量的对数成反比。如果要准确地确定DNA片段的大小，必须用DNA分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准是λDNA的HindⅢ酶解片段以及λDNA的HindⅢ+EcoRⅠ的酶解片段，不同分子量标准品可从各生物技术公司的产品目录中查到，（如Takara公司等），可根据不同需要采用合适的酶。

BamH IoriPXX(900bp)M 1 2BamH IpMD18-XX(+)3500 bpLac Z20001000750500250100图1 质粒酶切鉴定示意图

在载体上，基因XX（900bp）两端有BamH I酶切位点，可以通过BamH I进行酶解反应鉴定，右侧为酶解反应的示意图，M为Marker，Lane1为没有酶切的质粒，Lane2为质粒酶切后的电泳结果，可以看到一个预期的片段。

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BamH I200bpBamH I700bporiPXX(900bp)pMD18-XX(+)3500 bpLac ZM 1 2 3 4 BamH I 700bp BamH I 200bp XX(900bp) pMD18-XX(-) 3500 bp Lac Z ori P 20001000750500250100

图2 利用酶切的方法鉴定基因在载体上的接入方式

分别在载体上和基因上选择一个酶切位点，可以相同也可以不相同，而此酶切

位点在其它处没有。在基因上的酶切位点不能在基因的中间位置，否则不能进行鉴定，通过对所得产物可以判定基因的接入方式，M为Marker，Lane1、Lane2分别为质粒A未有酶切和酶切后的电泳后的结果，Lane3、4分别为质粒B未有酶切和酶切后的电泳后的结果。从图中可以判定质粒A为正义，而B为反义。

应该指出的是，质粒酶切鉴定是一种简便的方法，但不是金标准，尤其是从外

国学者获得的质粒，最好是进行测序验证。

实验方法： 小量酶解反应操作：

一般的反应是20μl体积中含0.2-1μgDNA，酶切反应体系如下：

质粒DNA 10×缓冲液 限制酶

10μl 2μl 1μl

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双蒸去离子水 总体积

操作方法

按下列顺序加入试剂：

7μl 20μl

（1） 在一灭菌的新的Ep管中加入7μl双蒸水。 （2） 加入10×缓冲液2μl。 （3） 加限制内切酶1U （4） 最后加入质粒DNA10μl （5） 稍离心，混合 （6） 37℃水浴1-1.5h。 （7） 取出后电泳分析鉴定。

注意事项

（1） 双蒸水为可变体积，当其他反应成分确定后，用双蒸水将反应体积补足。 （2） 质粒DNA最后加入，以防止操作不当引起试剂的污染。

（3） 为保持限制内切酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的冰浴

中，操作应迅速，用后立即放回低温冰箱中。

（4） 大多酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。若要取多种酶，每种酶必须单

独使用吸头，避免交叉污染。

（5） 大多数限制内切酶加50%甘油缓冲液置于-20℃保存，其活力稳定，但在配制

反应混合物时，酶的加入量应准确限制小于总体积的1/10，否则甘油会抑制酶解反应。

（6） 欲节省酶的用量，可增加酶解时间，但酶解时间过长，易出现杂酶活性。 （7） 当样品加入反应管中后，必须将管盖盖严，避免温育时水蒸气进入管内。

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实验六：酶切产物的回收

在重组DNA或探针标记等实验中，常常需要从凝胶中回收和纯化DNA，常用的方法有：压碎浸泡法、低熔点琼脂糖和DEAE-纤维素膜法等。 一、 DNA的回收

（一） 压碎浸泡法

本法适用于从3.5%～5%聚丙烯酰胺凝胶中回收小分子量（小于1kb）的DNA片段，亦适用于从琼脂糖凝胶上回收大分子的DNA片断。本法的优点是简单，从聚丙烯酰胺中分离的DNA纯度高，不含酶抑制物及对转染细胞有毒性的杂质，但回收率低，不能回收大片段的DNA片段。 仪器与主要试剂：

（1） 洗脱缓冲液

0.5mol乙酸铵 10mmol乙酸镁 1mmol EDTA（pH0.8） 0.1% SDS （2） TE缓冲液

（3） 3mol乙酸钠（pH5.2） （4） 100%和70%的乙醇 实验方法：

（1） 用刀片将凝胶中的DNA片段连同保鲜膜一同切下，然后从保鲜膜中拿出

所需的凝胶条。回收放射显影确定的DNA时，先在X线片上和所需DNA片段相对应的位置切一个小方洞，然后将凝胶和X线片对齐，切下所需的凝胶条。

（2） 将凝胶条放入Ep管中，用小玻璃棒捣碎凝胶。

（3） 估计凝胶条的体积，向离心管中加入1～2倍体积的洗脱缓冲液。 （4） 盖紧管盖，在37℃下轻摇，小片段（小于500bp）洗脱3～4h，大片段

DNA则需要洗脱12～16h。

（5） 4℃离心12 000g×1min,用拉长的别吸管将上清液转至另一个新的离心管

中，转移时要小心，不要带上聚丙烯酰胺凝胶的碎片。

（6） 再加0.5体积的洗脱缓冲液，混匀后，离心，合并两部分上清液。 （7） 将上清液通过一个装有硅烷化玻璃棉的一次性100μl吸头，除去残余的聚

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丙烯酰胺凝胶的碎片。

（8） 加2.5倍体积的乙醇，置-20℃30min，12000g离心10min，回收沉淀的

DNA。

（9） 用200μl的TE（pH8.0）溶解DNA，等体积酚和氯仿：异戊醇各抽提一

次，将水相转移至另一Ep管中。

（10） 加1/10体积的3mol乙酸钠，和2.5倍体积的乙醇再次沉淀DNA，置

-20℃30min。

（11） 离心，12000g ×15min弃去上清液，用70%的乙醇淋洗沉淀，真空干燥后，

将DNA溶解于10～20μlTE缓冲液（pH8.0）中。

附：冻溶法从琼脂糖凝胶中回收DNA [操作方法] （1） （2） （3） （4） （5）

从琼脂糖凝胶中将含有拟回收DNA片段的胶块切下，置于Ep管内。 用玻璃棒将胶块充分捣碎，加等体积平衡酚混匀后，置液氮10min。 取出立即离心，5000g ×5min。 小心地将水相转移到另一EP管中。

在原EP管内加200μlTE缓冲液（pH8.0），充分混匀。必要时可用玻璃棒再次捣碎，置液氮10min。

（6） （7） （8）

离心，5000g ×5min。将水相转移并合并至含有是次水相的Ep管中。 加等体积酚和氯仿：异戊醇各抽提一次。

在转移出的水相中加1/10体积的3mol乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇置液氮10min。

（9）

离心，12000g ×15min，弃去上清液，用70%的乙醇洗一次，真空干燥。

（10） 将沉淀用20μlTE缓冲液（pH8.0）溶解，-20℃保存备用。

（二） 低熔点琼脂糖法

有许多型号的低熔点琼脂糖可在65℃时熔化成液体，在30℃时凝固成凝胶。由于双链DNA的解链温度高于65℃，所以可熔化凝胶而DNA并不变性，在凝胶成液态时回收DNA片段。该法的优点时可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、进行限制酶切割和连接反应等。 仪器与主要试剂：

低熔点琼脂糖 TE缓冲液 平衡酚

氯仿：异戊醇（24：1） 10mol/L乙酸钠

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