研究生分子生物学实验讲义(6)

称55.2毫克于灭菌Eppendorf管中，加1毫升无菌水，溶解后存于－20℃备用。

5. 10×T4DNA连接酶缓冲液

660mmol/L Tris-HCl(pH7.5); 50mmol/L MgCl2 50mmol.L DTT 10mmol/L ATP

配制方法: 吸取高浓度贮存液

1mol/L Tris-HCl （pH7.5） 660μl 1mol/L MgCl2 50μl 1mol/L DTT 50μl 100mmol/L ATP 100μl 加ddH2O至1000μl，混匀-20℃贮存备用。 6． 电泳试剂同前。

实验方法：

1． 取3只灭菌的Eppendorf管，用记号笔做好标记，①号管做重组连接，②号管做载体片段未经CIP的处理的自连，③号管做载体片段经CIP处理的自连。

2． 各自的反应体系如下：

反应体系 ① ② ③ CIP处理的载体片段 5μl（100ng） 3μl（60ng） 未经CIP处理的载体片段 3μl（60ng） 目的基因片段 5μl（约400ng）

10XT4连接酶缓冲液 2μl 2μl 2μl ddH2O 7μl 14μl 14μl T4连接酶 1μl（2U） 1μl（2U） 1μl（2U） 总体积 20μl 20μl 20μl

用微量进样器加样，顺序为ddH2O，10×T4连接酶缓冲液，DNA片段，最后加T4DNA连接酶（放于冰浴中）。连接酶用后立即放回－20℃保存。

3． 盖紧盖子用手指轻弹Eppendorf管或用微量进样器混匀反应液，于台式离心机转2秒钟，以集中样品。

4． 将各反应管置温度已调至12℃的保温瓶内，盖紧瓶盖，过夜。

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5． 第二天上午各管取约25ng的DNA连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接反应效果，电泳时需以载体酶切片段、目的基因酶切片段作为对照。

6． 操作中药注意微量取样的准确性，加入溶液多，不可漏加或误加，取样时Tip头要从溶液的表面吸取，放样要彻底。

7． 12℃水浴连接反应时要盖紧盖子，以防止水渗入管内。 提示：

（一） 外源DNA与质粒载体的连接

外源DNA片段与线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA的5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成的新的共价键。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒DNA已去磷酸化，则仅能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂交体导入感受态细胞后可被修复。相邻的5’磷酸和3’羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和噬菌体T4DNA连接酶。实际应用中，噬菌体T4DNA连接酶是首选用酶，这是因为在一定反应条件下，它能有效地将平端DNA片段连接起来。

在基因工程中，外源DNA片段与载体DNA之间的连接方式很多，如粘性末端连接、平端连接、人工接头法等、

1． 粘性末端连接法，利用单一内切酶或两种不同的内切酶将DNA切出粘性的末端，DNA粘性末端间的碱基可互补配对，这种碱基间的识别配对可在较低的温度下完成，然后利用连接酶将缺口封闭。如本实验中使用的EcoR I酶切即是产生粘性末端。对于两个不同粘性末端的载体与目的基因，连接后转化子重组的机率很高，而且转化子的目的基因以一个方向插入载体质粒中。EcoR I酶相对其它内切酶来说，制备方法成熟、产量高，是最便宜的一种内切酶，因而被广泛使用。

2． 平端连接法，即不用专一性限制性内切酶酶切位点，而利用某些酶对DNA能切出平整的末端，然后用T4DNA连接酶将两者连接，这就是平头(blunt end)连接法。它要求DNA的浓度高，连接酶的用量比粘性末端的连接大20～100倍，因此较少被采用。

3． 人工接头（linker）法，它是在要连接的外源DNA或载体DNA的末端，先接上一段互补的人工接头，该接头上有内切酶识别位点（已有多种人工接头商品出售，如BamH I接头EcoR I接头、Pst I接头等等）。这些接头可在用一种或二种限制性内切酶将其切开，产生粘性末端，将外源基因与载体DNA连接。几种接头的连接所产生的转化效率不同。也有用平端接头的，但较少使用。使用人工接头方法的优点法还在于可以根据接头设计通用引物，对克隆进行PCR鉴定。

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上述几种连接方法，连接效率也各不相同。平头连接产生的转化中，载体自连的机率高，重组质粒在载体与目的基因结合处的限制性酶切位点消失，而且，在重组质粒中往往有目的基因的多聚体。对于两个不同粘性末端的载体与目的基因，在连接前最好要对各片段分别纯化，这样，连接后转化子重组的机率很高。对如相同粘性末端的载体与目的基因的连接，转化子自连机率高（可以用CIP处理，减少自连），而且重组子中目的基因以两个方向插入载体质粒中，重组子中往往也带有目的基因的多聚体。一般情况下，粘性末端连接产生的重组子的载体与目的基因结合处的限制性内切酶位点尚可保留，但也有例外：如BamH I、Bcl II酶切后粘端相同，但连接重组后，各自的识别位点都失去，也就不能切割了。因此，在连接液中加入BamH I或Bcl II进行酶切，就可以减少载体自连。 （二） 影响基因连接的因素

1． 连接酶的用量： 在一般的情况下，酶浓度高反应速度快、产量也高， 但是当使用的连接酶单位下降时，要加入大量的连接酶，而连接酶是保存在50％甘油中，因此在连接反应体系中由于甘油含量的过高，会影响连接效果。如果连接酶的纯度欠佳，加进的连接酶达到一定浓度后，再增加酶量对加快反应速度并不明显，而杂酶（如降解酶）的作用变得明显，从而影响产率。

2． 作用时间与温度：反应时间是与温度有关的，因为反应速度随温度的提高而加快。在我们的实验中，采用12℃～15℃与8℃～9℃两种温度，也有人尝试采用4℃～5℃反应一周，效果良好。但在选择反应温度与时间关系时，要考虑反应系统中的其它因素的影响。

3． 底物的浓度：一般采用提高DNA的浓度来增加重组的比例，但是当底物浓度过高，反应体积太小（即浓度太大）时，连接效果也很差，这可能是分子运动受到阻碍。当DNA连接浓度太低与连接体积太大也易于造成DNA的自连而产生重组子中的多聚体。

4．干扰因素： 在酶切与连接反应中，除了要求较高质量的纯酶以外，也要排除其它干扰因素，如EDTA的存在会抑制酶的活性，DNA样品中如有蛋白质、RNA存在，也会妨碍酶与DNA的直接作用，因而影响酶切与连接效果。当酶切结束，为了除去加进的内切酶以及在终止酶切反应时所加进去的EDTA，都需要进一步提纯DNA样品，如果采用直接混合DNA酶切样品进行连接，势必会产生一些干扰作用。所以一般只能用加热方法终止酶切反应，由于采用两者直接混合连接，在酶切时就要计划好酶切后的连接体积与浓度，不可能依靠进一步纯化样品时来浓缩与控制DNA连接体积。

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实验八：T载体应用时的DNA连接

目的：学习一种简单快速的DNA重组连接方法，即T载体连接法(也称TA克隆法)。将PCR扩增的基因片段经纯化后直接与一种特殊载体即pMD 18－T载体进行连接，构建体外重组DNA分子。

原理：大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个或几个―A‖碱基的特性；pMD 18－T载体是在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I 识别位点之间插入了EcoR V识别位点。用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加―T‖而成。利用PCR产物3’末端的―A‖碱基与T载体3’末端的―T‖碱基间的互补配对，经连接酶作用，完成PCR产物与载体的连接。

仪器与试剂：

1． pMD 18－T Vector（TaKaRa公司） 2． PCR扩增产物 3．T4 DNA连接酶

4．10×T4DNA连接酶缓冲液（同第一节） 5．电泳试剂同上一章

5． PCR产物纯化试剂或试剂盒

实验方法：

（一）PCR产物的准备

PCR产物与T载体连接前最好进行纯化，以减少引物及其它杂质对连接的影响。纯化方法可以采用PCR产物纯化试剂或试剂盒。下面介绍常规纯化方法。

1． 加等体积氯仿于PCR反应产物中室温高速离心1-2 min。 2． 去除管底的石蜡油。

3． 再离心2 min，去除管底微量的石蜡油，务必除尽。 4． 在PCR产物中加等体积的异丙醇，振荡，室温放置30min。 5． 4℃全速离心20mins，70%乙醇洗涤。 6． 真空干燥。

7． 重悬 DNA于 8-10μl ddH2O中, 加loading buffer 并上样于 1.5% 琼脂糖凝

胶进行DNA分离， DNA量越多越易克隆。 8． 切下条带，尽量减少紫外光下暴露时间。

（说明：1.在使用热盖PCR扩增时，多不加石蜡油，因此可省去操作1～3; 2. 若是构建cDNA文库，例如限制性cDNA文库，因PCR产物中含有多种cDNA片段，则应

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该用PCR产物纯化试剂盒进行纯化）。 （二） PCR产物同T载体的连接

1． 65℃加热凝胶条10min， 置37℃水浴。 2． 微型离心管中加入下列连接反应液， 反应体系 10×连接缓冲液 pMD 18－T 载体

① 2μl 1μl

② ③ 2μl 1μl

10μl

15μl 1μl 20μl

7μl 1μl 20μl

16μl 1μl 20μl

2μl

④ 2μl 1μl

PCR扩增产物（凝胶） 10μl ddH2O T4DNA连接酶 总体积 3． 12℃保温过夜。 4． 加入100μl H2O。 5． 68℃加热混合物5min。

6． 用酚、酚：氯仿及氯仿抽提，除去凝胶。 7． 加10μl 3M NaAc（pH5.2） 用乙醇沉淀。

6μl 1μl 20μl

Control Insert DNA 1μl

8． 用70%的乙醇洗涤沉淀，真空干燥，转化前溶入5μl H2O。

说明： 对于②、 ④ 则不进行5～6步的操作） 2. 若用PCR产物用试剂盒纯化，则可按如下反应体系进行： 反应体系

10X 连接缓冲液 pMD 18－T 载体 PCR扩增产物 ddH2O T4DNA连接酶 总体积

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① 1μ 1μl

② 1μl

③ 1μl 3μl 5 μl 1μl 10μl

④ 1μl 1μl 7μl 1μl 10μl

1μl 1μl 6μl 1μl 10μl

3μl 4μl 1μl 10μl

Control Insert DNA

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