研究生分子生物学实验讲义(3)

环状、开环状分子、线状分子三种不同的构型，这三种分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。用荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide, EB ）进行检测，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。

仪器与主要试剂： 仪器：

1) 2) 3)

电泳仪 水平电泳槽 紫外检测仪

主要试剂：

1) 提取的质粒DNA

2) 5×TBE：54gTris; 27.5g硼酸; EDTA (0.5mol/L, pH 8.0) 20ml, 加水至1L，用

前稀释10倍

3) 溴化乙锭（EB）：10mg/ml溶液 4) 溴酚蓝

实验方法：

1) 称取1g琼脂糖于100ml 0.5×TBE中，加热溶解，冷却至65℃左右再加入终

浓度为0.5%-1.0%的EB。

2) 电泳胶模两端用透明胶带封固，梳子至于适当位置，将冷却至65℃左右的琼

脂糖溶液慢慢倒在胶模上，厚度约3㎜。静置，待胶凝固后揭去胶模两端的透明胶带，放入电泳槽内，倒入适量电泳缓冲液（一般液面高出凝胶1㎝），小心拔出梳子。

3) 将5μg提取的质粒DNA样品，与等体积溴酚蓝指示剂混匀，加入凝胶点样

孔内，防止产生气泡和样品溢出。 4) 将电泳槽通电，80V恒压电泳30分钟。

5) 电泳完毕，关掉电泳仪，倒去电泳槽中的电泳缓冲液，小心取出凝胶置于紫

外灯下观察结果，质粒DNA条带发出红色荧光。

注意事项：

1) 防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。

2) EB是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有EB的溶

液在弃置前应当进行净化处理。

7

第二章

实验三：基因的PCR技术

目的基因的获取

目的：①学习PCR的基本原理与实验技术；②了解引物设计的一般要求

原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种最常用的体外基因扩增技术，其工作的基本原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5’末端和3’末端相互补的寡核苷酸为引物，在特殊的耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过多次循环反应，前一循环的产物DNA可继续作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使得目的DNA片段的量按2方式呈指数级递增，所以该反应称为链式反应。组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、耐热DNA聚合酶、dNTP以及含Mg2+的缓冲溶液。

PCR包括三个基本反应步骤：①变性：将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间局部双链也得以消除；②退火：将温度下降至适当温度，两个引物分别结合到靶DNA两条单链的3’末端；③延伸：将温度升至72℃，DNA聚合酶催化dNTP加到引物的3’末端，引物沿着靶DNA链由3’端向5’端延伸。上述三个步骤为一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经数小时的多次循环(25～40次)后，靶DNA片段的扩增倍数可达10～10。

PCR成功的关键往往在于寡核苷酸引物的正确设计。要保证PCR能准确、特异、有效地对靶DNA进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15～25个核苷酸；②GC含量为40%～60%；③Tm值高于55℃；④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%；⑤两条引物间配对碱基数小于5个；⑥引物自身配对(特别是引物的3’末端)形成的茎环结构、茎的碱基对数不大于3。由于影响引物设计的因素比较多，实际应用中基本是利用专门的引物设计软件进行引物设计。

仪器与主要试剂：

1. 基因扩增仪(如PE GeneAmp PCR System 2400 或 9700)、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管

2. DNA模板：质粒DNA(含靶基因片段)

3. 引物： A： 5’ GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’

8

6

9

n

B: 5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC3’ 4. Taq酶：5U/μl (SWELLXin) 5. 4×dNTP: 10mM each

6. 10×buffer: 500mM KCl , 100mM Tris-HCl (pH 8.3) 7. MgCl2: 25mM 8. 灭菌去离子水

实验方法

(一) 准备PCR反应溶液(最好于冰上进行)：

1.

2×Premix的配制 无菌去离子水 10×buffer 4×dNTP MgCl2 Taq酶 共 2.

准备PCR反应溶液：

取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每5840μL 2000μL

400μL (终浓度：0.4mM) 1600μL (终浓度： 4mM) 160μL (终浓度约0.1U/μL)

10mL ，混匀，按需分装，-20℃ 保存

换一种试剂换一个新吸头)：

灭菌去离子水 2×Premix 引物1 引物2 质粒DNA 共

19μL 25μL 2μL 2μL

2μL ( 约3ng) 50μL 混匀

如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上。 (二) PCR扩增反应条件：

94℃ × 5 min

94℃ 72℃

72℃ × 5min (三) 结果检测

9

30sec 30sec 60sec

30个循环 50℃

本实验所扩增的产物DNA片段长度约400bp, 可取1μL～5μL产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。具体操作方法见前。

实验四：DNA限制性酶切技术

目的：学习体外构建或鉴定重组DNA分子时，根据目的基因及载体选择合适的限制性内切酶。

原理：各种II型限制性内切酶能识别特定的DNA碱基序列。这样，利用特定的限制性内切酶就能切割靶DNA的特定部位，得到特定长度的DNA片段或是得到特定粘性末端。选用某种限制性内切酶切割DNA，不同来源的DNA因序列的不同而相应酶切位点的位置和数量不同，即有不同的酶切图谱，以此可对DNA进行鉴别。在基因工程重组体的构建中，一般也必须选用合适的一种或两种限制性内切酶分别作用于目的基因以及载体，以得到相互匹配的粘性末端。继而在连接酶的作用下连接成为重组DNA分子。一般来说，对目的基因使用某种限制性内切酶，相应的载体也要用同样的酶。

只用一种限制性内切酶时的酶切反应即单酶切，酶切后的产物两个末端相同。单酶切反应较简单，但目的基因片段经单酶切处理后能以两个方向插入到载体中，甚至靶基因DNA片段能串联后再插入到载体中，且可自连(同样处理的载体也有类似不足)，因而重组效率较差，不利于重组子的筛选。用两种不同的限制性内切酶切割目的基因称为双酶切，酶切反应本身稍复杂，但得到的靶基因片段只能以单方向插入载体，一般也不存在自连现象，理论上重组效率更高。

仪器与主要试剂：

恒温水浴锅

纯化的质粒DNA(约3000bp, 100ng/μL)

限制性内切酶(TaKaRa)： Hind III (15U/μL), EcoR I (12U/μL) 酶的贮存缓冲液： Hind III EcoR I

10mM Tris-HCl 10mM Tris-HCl 400mM KCl 100mM KCl 0.1mM EDTA 0.1mM EDTA 1mM DTT 1mM DTT 0.01% BSA 0.15% Triton X-100 50% 甘油(pH 7.5) 0.01% BSA 50% 甘油(pH 7.5)

10

10 × Buffer: 100mM Tris-HCl(pH 7.5) 100mM 10mM 500mM

MgCl2 DTT NaCl

无菌去离子水

实验方法(以双酶切法为例)：

在0.5ml Eppendorf管中按顺序依次加入下述试剂，混匀后即成酶切反应体系：

无菌去离子水: 10 × buffer 质粒DNA Hind III (15U/μL) EcoR I (12U/μL) 共

将反应管置37℃水浴1～3h

反应结束后取10μL反应产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测并观察结果，酶切产物应为2700bp和350bp两个片段。

11

11μL 2μL

5μL(共500ng) 1μL 1μL 20μL

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