分子生物学实验讲义
硕 士 研 究 生 试 用 教 材(第三版)
南方医科大学 生物化学与分子生物学教研室
二OO六年五月
分
子
生
物
学
实验讲义
硕 士 研 究 生 试 用 教 材（第三版）
编 写 人 员 (按姓氏笔画排列)
冯春琼 朱利娜 吴清华 宋艳斌 张兴梅 李 凌 肖应庆 肖维威 姜 立 胡子有 郭秋野 彭翼飞
南方医科大学 生物化学与分子生物学教研室
二OO六年五月
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前 言
分子生物学是二十世纪末发展最快的生命科学，其理论与技术的进步，不仅加速了自身体系的更新，同时也带动了医学科学的变革。随着科技的日新月异，分子生物学的研究手段也得到相应发展，PCR技术、克隆技术、基因芯片技术等的涌现，使得分子生物学溶入到生命科学的各个领域，并发挥着巨大作用。分子生物学是实践性非常强的一门课程，众多的理论知识必须在实验中进行验证，才能深刻地理解与应用。
开设分子生物学实验选修课程，是医学院校研究生层次人才培养的必要组成。为适应新形式下研究生教学的需要，我们在完善实验室仪器配置标准化的同时，安排了以基因重组体的构建为主线的一系列实验内容，旨在让研究生掌握分子生物学基本技术操作的同时，并能有严谨的实验思路，具备一定的分子生物学科研思维，避免在课题设计上出现不必要的误差。
此次编写的讲义，必然会有欠缺与不足，我们会在今后的工作中不断修正与补充。希望大家对本门课程提出宝贵意见，以帮助我们更好的开展分子生物学实验的教学工作。
生物化学与分子生物学教研室
二OO六年五月
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目 录
第一章
基因克隆载体的制备………………………………………………… 1
实验一：质粒DNA的抽提与纯化……………………………… 1 实验二：质粒DNA的鉴定……………………………………… 6
第二章
目的基因的获取……………………………………………………… 8
实验三：基因的PCR技术…………………………………………8 实验四：DNA限制性酶切技术……………………………………10 实验五：酶切产物的鉴定………………………………………… 12 实验六：酶切产物的回收………………………………………… 15
第三章
基因重组子的构建…………………………………………………… 19
实验七：DNA重组连接……………………………………………19 实验八：T载体应用时的DNA重组连接……………………… 25 实验九：重组DNA的转化……………………………………… 29 实验十：重组子的鉴定…………………………………………… 31
第四章
SDS－PAGE检测蛋白………………………………………………… 34
实验十一：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳………………………… 34
第五章
附录……………………………………………………………………… 38
第一章
基因克隆载体的制备
实验一：质粒DNA的抽提与纯化
目的： 原理：
采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术，
碱变性抽提质粒DNA的质粒DNA是基于染色体DNA与变性与复性的差异
而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
仪器与主要试剂： 仪器（见附录）： 主要试剂：
实验方法：
1． 将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫
升试管里，37℃振培过夜，16～18小时
2． 转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒
3． 小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀 4． 加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟
5． 加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰
溶液I：
50 mmol/L 葡萄糖
10 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸） 2毫克/毫升 溶菌酶 1% SDS（十二烷基硫酸钠）
25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) Tris（三羟甲基氨基甲烷） 溶液II： 200 mmol/L NaOH 溶液III： 3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5
1 mmol/L EDTA
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