研究生分子生物学实验讲义(5)

100%和70%乙醇 实验方法：

（1） 用一般琼脂糖凝胶的制备和电泳方法进行低熔点琼脂糖的电泳； （2） 电泳结束后，将含有所需DNA片段的凝胶条切下，放入Ep管中，加入

3倍体积的TE缓冲液，在70℃保温10min，以使凝胶熔化。

（3） 冷却至室温后，加入等体积的酚，充分混匀后以4000g离心10 min，回

收水相，主意不要将截面的白色物质（即粉状的琼脂糖）吸出，再用等体积氯仿：异戊醇抽提一次。

（4） 将上清液转移到一个新的小离心管中，加入0.2倍体积的10mol/L乙酸铵

和2倍体积的乙醇，混合液在室温中放置10min，然后离心沉淀核酸。

二、 回收DNA的纯化 实验方法：

（1） 用20 倍体积含0.6mol/LNaCl的TE（pH7.6）悬浮DEAE-Sephacel，树脂

沉淀后，吸去上清液，再加20倍体积的同种缓冲液，轻轻地悬浮树脂，等树脂再次沉降后吸去大部分上清液，4℃下贮存经平衡处理的树脂。

（2） 将足以结合20μgDNA的0.6ml DEAE-Sephacel悬浮液装入小柱。 （3） 分别用下列缓冲液洗柱：

含0.6mol/L NaCl的TE（pH7.6） TE（pH7.6） 含0.1mol/L NaCl的TE（pH7.6）

3ml 3ml 3ml

（4） 将DNA与加样缓冲液混合上样，将收集的洗脱液加回到柱上。 （5） 用含0.3mol/L NaCl的1.5ml TE（pH7.6）洗柱2次。

（6） 用含0.6mol/L NaCl 1.5ml TE（pH7.6）洗柱3次收集DNA 洗脱液。 （7） 将洗脱液转移到离心管，加等体积的异丙醇，混匀后在室温下放置15min，

4℃12000g离心10min沉淀DNA。

（8） 70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥后，溶于200μl TE（Ph7.6）中。 （9） 用等体积分和氯仿：异戊醇各抽提一次，转移水相至一Ep管中。 （10） 加入1/10体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇置-20℃

30min。

（11） 离心，12000g ×15min，弃去上清液，用70%的乙醇洗一次，真空干燥。 （11） 将沉淀用50μlTE缓冲液（pH8.0）溶解，-20℃保存备用。

目前有许多生物技术公司开发出进行此项操作的试剂盒，使用方便、快速，可参照说明书进行。下面附上海生工公司的试剂盒以供大家参考

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主要用途：从TBE或TAE琼脂糖胶中回收DNA片段。 主要特点：

i. ii. iii.

适用范围广，适合于从TBE和TAE琼脂糖胶中回收60bp～40kb的DNA片段，回收效率在80％以上。 省时，全部操作过程仅需20分钟。 操作过程中不需要酚抽提，乙醇沉淀。

50个 50个 20ml 25ml 2 ml

试剂盒组成：

UNIQ-5 columns Collection tubes Binding buffer Wash solutiona Elution buffer

首次使用前必须在Wash solution中加入等体积的无水乙醇，充分混匀后使用，每次使用之后将瓶盖盖紧，以保持Wash solution中的乙醇含量，如果您发现Wash solution由于运输或保管不当造成容量严重不准，请用量筒定容后再加入等体积的乙醇。 操作步骤：

1) 用琼脂糖胶电泳将目的片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀

片割下所要回收的DNA琼脂糖块，放入1.5ml离心管中。

2) 按每100mg琼脂糖胶加入400μl Binding buffer，置于60度水浴中10分钟，

使胶彻底融化，加热融胶时，每2分钟混匀一次。

注意：对于高浓度的胶如1.5%～2％，每100mg加入700μl Binding buffer，加热融胶的进间可以延长到15min，以保证胶全部融化。

3) UNIQ-5 columns放入Collection tubes中，将融化的胶溶液转移至UNIQ-5

columns中，室温放置2分钟，室温离心(8000rpm)1min。

4) 取出UNIQ-5 columns，弃去收集液，将UNIQ-5 columns再次放入Collection

tubes中，加入450μl Wash solution，室温离心(8000rpm)1min。 5) 重复步骤4。

6) 取出UNIQ-5 columns，弃去收集液，将UNIQ-5 columns再次放入Collection

tubes中，室温离心(12000rpm)1min。

7) 将UNIQ-5 columns放入一个新的Ep管中，在柱膜中央加入30μl的Elution

buffer，室温放置2min。

8) 室温离心(12000rpm)1min，离心管中的液体即含有回收的DNA片段，可立

即使用或者-20℃贮存。

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第三章

实验七：DNA重组连接

基因重组子的构建

DNA重组子的构建中一般使用DNA连接酶，该酶是1967年在三个实验室同时发现的能封闭DNA链上缺口的酶，它借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。

噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链，分子量为60KD，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA- RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外，NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率，而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

DNA连接酶所催化的整个过程是可逆的。酶-AMP复合物可以与NMN或PPi反应生成NDA或ATP及游离酶;DNA-AMP也可以和NMN及游离酶作用重新生成NAD。该逆反应过程可以在AMP存在的情况下使共价闭环超螺旋DNA被连接酶催化，产生有缺口的DNA-AMP，生成松弛的闭环DNA。

在真核生物细胞中也存在DNA连接酶，且有两型，分别称为连接酶Ⅰ和Ⅱ，反应中利用ATP所提供的能量。DNA连接酶Ⅰ分子量约为200KD，主要存在于生长旺盛细胞中，DNA连接Ⅱ分子量约85KD，主要存在于生长不活跃的细胞中(resting cell)。

目的：用T4DNA连接酶将EcoR I酶切并经碱性磷酸酶（CIP）处理的载体pUC18的DNA片段，与目的基因被同一内切酶EcoR I 处理的片段连接起来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。

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原理：重组DNA分子是在Mg2＋、ATP或NAD存在的连接缓冲液系统中，DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键，将两种 DNA分子进行连接。

（一） DNA连接作用步骤

1． 辅助因子NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的ε─氨基上形成共价的酶-AMP复合物（腺苷酰酶），同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸。

2． 酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA上，将酶-AMP复合物上的腺苷酰基再转移到DNA的5'-磷酸基端，形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-AMP。

3． 这个被激活的5'-磷酰基端可以和DNA的3'-OH端反应，产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来，同时释放出AMP，见下图。

DNA连接酶所催化的整个过程是可逆的。酶-腺苷酸复合物可以与NMN或PPi反应生成NDA或ATP及游离酶；DNA-AMP也可以和NMN及游离酶作用重新生成NAD。该逆反应过程可以在AMP存在的情况下使共价闭环超螺旋DNA被连接酶催化，产生有缺口的DNA-腺苷酸，生成松弛的闭环DNA。

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（二） DNA的连接方式

在T4DNA连接酶作用下的DNA连接反应，一般是随机的，但也可以通过对载体、目的基因的处理以控制与调整DNA的有效连接。

连接方式有：

1．自连，如pUC18 EcoR I片段的自连，可以通过CIP处理克服。目的基因片段的自连由于不带复制起始点，不能在抗性平板上生出菌落，而且可以通过调整DNA浓度比与缩小连接体积减少自连的机率。

2．两种片段相连接，如两个目的基因片段之间，目的基因片段与载体DNA片段之间，前者在抗性平板上不能生长。

3．三个片段以上的自连与互连，一般这种机率较少，双酶切的DNA片段机率更少。总之，连接的组合方式有多种，通过控制载体DNA与目的DNA片段的分子比例，可以影响重组率。一般情况下，对分离片段来讲，载体DNA的摩尔数与目的基因的摩尔数之比为1比5。但目的基因的比例太高，容易产生基因自连后插入载体的多聚体。连接体积太大自连机会增多。 （三） 连接反应条件

1． 缓冲液： 一般都配成5倍到10倍的缓冲液，有Mg、ATP作为辅助因子，提供能量，同时也有些保护与稳定酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）以防止酶的活性基因氧化失活。BSA（小牛血清白蛋白）维持一定的蛋白量，以防止因蛋白浓度太低导致酶变性失活。

2． 温度： 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的，EcoR I酶切所产生的末端，仅仅通过四个碱基对相结合，这不足以抵抗该温度下的分子热运动。因此做实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反应，其温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度，为12～16℃。

3． 时间： 12～16小时（过夜）。TaKaRa公司的T4 DNA连接酶在22℃条件下，只需1小时。

仪器与主要试剂：

1． pUC18 EcoR I –CIP处理的DNA片段 2． 目的基因的EcoR I回收片段。 3． T4 DNA连接酶 4． 高浓度的贮存液 （1）1mol/L MgCl2溶液。 （2）1mol/L DTT溶液。 （3）100mmol/L ATPNa2

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