PTEN、VEGF和MMP2在胃癌组织中的表达及其与胃癌浸润、转移和预后(12)

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免疫组化ＳＰ法的各步骤均有可调性，如抗原修复方法、抗原修复液的选择、

各步骤反应时间、反应温度等。为了更好地观察各指标的表达情况，本实验通过多次预实验对上述条件进行了优化，具体步骤如下：

一

（１）于６０。Ｃ恒温箱中烤片５—８小时。

（２）二甲苯及梯度酒精脱腊、水化，二甲苯３次，每次５分钟（５’×３，下同），

无水酒精５７×２，９５％酒精５７×１，９０％酒精５７×１，７５％酒精５’×１，蒸馏水冲洗。

（３）ＰＴＥＮ采用高温高压抗原修复：将脱腊水化后的组织切片放置在耐高温塑

料切片架上，置于沸腾的柠檬酸盐缓冲液中（０．０１Ｍ，ＰＨ６．０＋０．０１），加盖扣阀，达工作温度和压力２分钟后，压力锅离开热源，１分钟后自来

水冲淋冷却，去阀开盖，取出玻片，ＰＢＳ（ＰＨ＝７．４）冲洗三次，每次５分钟

（５’×３，下同）。

（４）每张切片加５０ｕ１３％Ｈ：伤（Ａ液），室温（或３７。Ｃ温箱中）孵育１５’，阻断

内原性过氧化物酶活性，ＰＢＳ冲洗５’ｘ３。

（５）每张切片加非免疫性动物血清（Ｂ液）５０儿ｌ，室温孵育ｌＯ分钟。（６）甩去多余液体，每张切片加第一抗体５０ｐｌ，４。Ｃ过夜。（７）ＰＢＳ（ＰＨ＝７．４）冲洗５’×３。

（８）甩去ＰＢＳ液，每张切片加通用型生物素标记羊抗兔、抗鼠ＩｇＧ（Ｃ液）５０ｕ－１，

室温孵育１５分钟，ＰＢＳ（ＰＨ＝７．４）冲洗５’Ｘ３。

（９）甩去ＰＢＳ液，每张切片加新鲜过氧化物酶标记链亲和素（Ｄ液）５０¨ｌ，室

温孵育１５分钟，ＰＢＳ（ＰＨ＝７．４）冲洗５’×３。

（１０）甩去ＰＢＳ液，每张切片加新鲜配制的ＤＡＢ溶液ＩＯＯＵｌ，避光显色３—１０

分钟，显微镜下控制显色。

（１１）自来水冲洗，苏木素复染，自来水冲洗还蓝。梯度酒精及二甲苯中脱水

透明，９５％酒精５’×１，无水酒精５’×２，二甲苯５’×２，切片干燥后，

中性树胶封固。

（１２）ＶＥＧＦ、ＭＭＰ２采用微波修复法，取５００ｍｌ的ｐＨ＝６．０的柠檬酸盐缓冲液倒

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