水果各指标测定方法(3)

注意事项

应进行预实验，测定每分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化(初级反应)的时间段。这样，只测定某一段时间内反应溶液的初始吸光度值(OD0 )和最终值(OD1)这两个数据，就可以计算每分钟吸光度值变化的增加量。

过氧化物酶（POD）

基本原理

过氧化物酶( peroxidase , POD)是果蔬体内普遍存在的一种重要的氧化还原酶，它与果蔬的许多生理过程和生化代谢过程都有密切关系。在果蔬的生长发育、成熟衰老过程、抗病、抗氧化、抗逆境胁迫中，过氧化物酶活性不断发生变化。在受到外界刺激、病原菌侵染、贮藏环境变化、加工条件改变等作用时，果蔬组织中过氧化物酶活性都会做出相应的应答反应。

过氧化物酶催化过氧化氢(H202)氧化酚类物质产生醌类化合物。这些化合物进一步缩合，或与其它分子缩合形成颜色较深的化合物。在过氧化物酶催化作用下，过氧化氢能将愈创木酚(邻甲氧基苯酚)氧化形成4-邻甲氧基苯酚。该产物呈红棕色，在470 nm处有最大光吸收，故可通过比色法测定过氧化物酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 (一)材料

各种水果和蔬菜。 (二)仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、秒表、移液器、离心管、试管、容量瓶(50mL,100mL,1000mL)。 (三)试剂

1、0. lmol/L,pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲液

母液A ( 200mmoL/L醋酸溶液):量取11. 55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000mL。

母液B ( 200mmo1/L醋酸钠溶液):称取16. 4g无水醋酸钠(或称取27. 2g三水合乙酸钠)，用蒸馏水溶解、定容至1000mL。

取68 mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5. 5，加蒸馏水稀释至1000mL。

2、提取缓冲液(含1mmoLPEG,4% PVPP和1 % Triton X-100)

称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000),4g PVPP(聚乙吡咯烷酮，

polyvinyl-poly-pyrrolidone)，取1mL Triton X -100，用0. lmol/L pH 5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。 3、25 mmol/L愈创木酚溶液

取320 μL愈创木酚，用50mmol/L pH 5. 5乙酸缓冲液稀释至100mL。 4、0. 5 mol/L H202溶液

取1.42mL 30% H202溶液(30% H202溶液的浓度约为17. 6mo1/L)，用50mmol/L pH 5. 5乙酸缓冲液稀释至50mL，现用现配，避光保存。

实验步骤 (一)酶液制备

称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加人5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000 x g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低

温保存备用。 (二)活性测定

取一支试管，加人3.0mL 25mmo1/L愈创木酚溶液和0. 5 mL酶提取液，再加人200 μL，0. 5 mol/L H202溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。将反应混合液倒人比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长470 nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1 min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。

实验结果与计算 1.测定数据记录 重复次数 样品质量m/g 提取液体积V/mL 吸取样品液体积VS/mL OD0 470nm处吸光度值 OD4 样品中过氧化物酶活性/(ΔOD470/min?g) OD5 ΔOD 计算值 平均值±标准偏差 OD1 OD2 OD3 2.计算结果 记录反应体系在470 nm处的吸光度值，制作OD470值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分计算每分钟吸光度变化值△OD470。

?OD470?OD470F?OD470I

tF?tI1 2 3 式中△OD470—每分钟反应吸光度变化值； OD470F—反应混合液吸光度终止值； OD470I—反应混合液吸光度初始值； tF—反应终止时间，min; tI—反应初始时间，min。

以每克果蔬样品(鲜重)每分钟吸光度变化值增加1时为1个过氧化物酶活性单位，单位是△OD470 /min·g。计算公式:

U??OD470?V

VS?m式中V—样品提取液总体积，mL ;

VS——测定时所取样品提取液体积，mL ; m—样品质量，g。

过氧化物酶活性还可以每分钟反应体系在波长470 nm处吸光度值读数变化增加1所需的酶量为1个活性单位，单位是△OD470 /min·mg蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。即:

U??OD470

VS?c 其中，c表示酶提取液中蛋白质含量(mg/mL)。这里所计算的实际上是酶的比活力，有利于减少操作过程带来的误差。

注意事项

(1)应进行预实验。测定每分钟反应体系的吸光度值的变化，确定该酶促反应速度呈线性变化(初级反应)的时间段。这样，只测定某一段时间内反应液的初始吸光度值( ODI)和最终值(ODF)这两个数据，就可以计算出每分钟吸光度值的变化量。

(2)利用0. lmol/L,pH 6.0磷酸钠缓冲液(配制方法见附录1)作为提取液，可以提取多数果蔬组织中过氧化物酶。

(3)在提取缓冲液中加人PEG,PVPP和Triton X-100等是为了提高酶蛋白的溶解性，减少提取过程中酶活性的损失。这些物质的具体作用可以参阅本书第一篇相关内容。

Vc含量：2，6－二氯靛酚法

原理：还原型抗坏血酸能还原染料2.6-二氯酚靛酚（2.6-D），该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2.6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2.6-二氯酚靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。

试剂与仪器设备 （1）1％HCl

（2）2％草酸溶液：溶解20克草酸结晶于200毫升水中，然后稀释至1000ml。

1％草酸溶液：取上述2％草酸溶液500ml，用水稀释至1000m1。 （3）NaHCO3，（4）1％淀粉溶液，（5）碘化钾。 （6）0.1N碘酸钾溶液：精确取干燥的碘酸钾0.100ml。0.3567克用水稀释至100ml. （7）抗坏血酸标准溶液：准确称取50mg抗坏血酸，溶于1％草酸溶液中，移入250ml量瓶中，并用1％草酸溶液稀释至250毫升，

（8）2.6-D溶液：称取碳酸氢钠52mg，溶于200ml沸水中，然后称取2.6-二氯靛酚50mg，溶解在上述碳酸氢钠的溶液中，待冷，此液应贮于棕色瓶中并冷藏. 标定方法：取5m1抗坏血酸标准溶液于50ml三角瓶，加入1％草酸溶液5滴以及5-10mgKI，摇匀，用0.001mol/L的KIO3溶液滴定滴定至溶液呈淡蓝色于15秒不褪色为止。另取5m1抗坏血酸标准溶液于50ml三角瓶，用的2，6-D溶液滴定至溶液呈粉红色

溶液的浓度（T）= ( V1×0.088)/V2

V1：滴定时所耗0.001N碘酸钾标准溶液的量(ml) V2：所取2，4-D的量(ml)

0.088：lml 0.0001N碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸的量(mg／mL)

仪器设备组织捣碎机、三角瓶、容量瓶、小烧杯、移液管 实验步骤：

称取0.5g样品，加等放入研钵中，加入约10ML1%HCl研磨，将提取液虑入50ml 容量瓶中，反复提起三次，最后用量1%HCl 定容至刻度。摇匀

然后迅速吸取5～10mL滤液，置于50mL三角瓶中，用标定过的2，6－二氯靛酚染料溶液滴定，直至溶液呈粉红色于15s内不退色为止。

为了检查试剂是否洁净，必须测定用来提取样品的1%HCl的还原力，为此5mL2%HCl作为空白，按同上方法进行滴定。所得值从滴定提取液的结果中减去，根据实际消耗2，6-D的量来计算抗坏血酸的量

计算：

抗坏血酸含量(mg/100g)=

(V?V0)?TV1??100

MV2V：滴定时所耗去染料溶液的体积(mL)

V0：滴定空白时所耗染料的体积(mL) V1：样品处理液体积(mL) V2：测定用样品液体积(mL)

T：1mL染料溶液相当于维生素C标准溶液的质量(mg) M：滴定时所需的滤液中含样品量的质量(g)

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