水果各指标测定方法(2)

（3）滴定：用硫酸亚铁铵溶液滴定过量的重铬酸盐。过量的重铬酸盐应不少于空白滴定中重铬酸盐用量的20％。滴定过程中每次滴加后均需摇动烧瓶，当试液颜色变为蓝绿时，加入4滴邻二氮菲亚铁溶液，继续滴加硫酸亚铁铵溶液，直至溶液由蓝绿色变为棕色，记下消耗滴定液体积(V2)。若滴定过了终点，可用高锰酸钾溶液准确的回滴至终点，由所用的硫酸亚铁铵溶液的体积减去所用高锰酸钾溶液体积的1/10，此差值即为(V2)。

（4）用同一制备好的样品做两个平行测定。

4、空白滴定：用等体积的蒸馏水代替馏出液，在同样的滴定条件下，进行空白滴定，所消耗的硫酸亚铁铵溶液的体积为V3。氧化时可适当加入一定体积的蒸馏水以使得滴定时终点明显。空白滴定时溶液的总体积要与试验部分总体积相同,以减少滴定误差。操作者也可根据情况,在滴定时选择以下指示剂:1mL正磷酸(85％)比重1.71加1mL浓度为0.5g/100mL的二苯胺磺酸钡溶液。 5、计算方法与公式

（1） 固体样品：乙醇含量表示为g/100g，按式(1)计算为

(V3-V2)? 100? 100 乙醇(g/100g) ? 0.01V1??V3? V0? m式中

m——为试样质量 g;

V0——用于滴定的馏出液体积,mL;

V1——为氧化时所用重铬酸钾溶液体积,mL;

V2——为回滴重铬酸盐所用硫酸亚铁铵溶液的体积,mL; V3——为空白滴定所用硫酸亚铁铵溶液的体积,mL。

（2） 液体样品

乙醇含量表示为g/100mL，按式(2)计算

(V3-V2)? 100? 100 乙醇(g/100mL) ? 0.01V1??V3? V0? V4式中:V0、V1、V2、V3——意义同5.2

V4——为试样体积,mL。

相对电导率

基本原理

果蔬细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。细胞膜具有选择透过性功能，果蔬细胞之间以及细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。果蔬组织后熟衰老过程中，细胞质膜功能活性下降，膜通透性增加，出现细胞内电解质向外渗漏。果蔬组织在受到不良环境胁迫时，如高温、低温、振荡伤害或病原菌侵染时，细胞膜的完整性和功能也会遭到不同程度的损伤，往往表现为膜透性增加和电解质外渗(主要是钾离子)速度加快。 果蔬组织细胞膜受损伤后，细胞膜内电解质外渗，会引起提取液的电导率增加。通过测定果蔬组织浸提液或外渗液的电导率，可以了解果蔬细胞膜通透性的变化，反映果蔬抗逆性的强弱或受到伤害的程度。一般利用相对电导率表示细胞膜渗透率以及细胞膜受到伤害的程度。

相对电导率(γe)为测试材料活组织提取液的电导率(γ1)与被杀死后提取液的电导率(γ0)的百分比，即:

???1?100% ?0 煮沸杀死果蔬活组织时，果蔬细胞完全破坏，细胞内电解质完全进人浸提液，因此，γe实际表示在一定时间内，细胞内电解质渗出量占总电解质的百分比。 三、材料及仪器 (一)材料

叶片或果蔬组织，取样部分要避免损伤。 (二)仪器及用具

电导率仪、电子天平、真空干燥器、真空泵、真空压力表、恒温水浴锅、小烧杯(100mL )、大试管、带十字头玻璃棒、不锈钢打孔器、单面刀片、摇床。

实验步骤 (一)取样

对于蔬菜，选取一定部位上生长龄相似的叶子，剪下后，先用纱布拭净，再用打孔器打取相同大小(直径8mm)的圆片，称取2.g叶肉圆片(要求各样品的圆片数目相同)。

对于果实，用打孔器打取果实(果肉或果皮)组织后，用锋利的刀片将果实组织切成相同厚度(2mm)的薄片，要求均匀一致，尽量减少损伤。称取相同质量(相同数目)的果实圆片。

将圆片置于小烧杯中，加人20mL去离子水浸泡、振荡10 min，将水倾去，再用去离子水冲洗3次，最后用干净滤纸吸干圆片上的水分。 (二)测定过程

将组织圆片放人大试管中，并用玻璃棒或干净尼龙网压住，准确加人20. 0mL去离子水，浸没叶片，放人到真空干燥器中。真空干燥器连接上真空表和真空泵，抽气，以抽出细胞间隙中空气，使去离子水进人细胞间隙。将真空干燥器的压力控制在0. 04~0. 06MPa,真空渗透l0min。然后，缓缓放人空气，水即被吸人组织中而使圆片下沉。取出大试管，放在摇床上振荡1h，在20~25℃恒温下，用电导率仪测定溶液电导率。

测定电导率后，将大试管再放人到100℃沸水浴中煮沸15 min，以杀死果蔬组织圆片。然后取出大试管冷却，至温度降到20~25℃时，再次测定煮沸后的果蔬组织电导率。

实验结果与计算

记录测定结果，按前面的公式计算相对电导率。重复三次，计算平均值和标准偏差。

注意事项

整个过程中，组织圆片接触的用具必须绝对洁净(全部器皿要洗净)，也不要用手直接接触叶片或果实组织，以免污染。测定后电极要清洗干净。此外，温度对溶液电导率的影响很大，必须在相同温度下测定活组织和杀死后组织的电导率。

丙二醛含量

基本原理

果蔬组织在后熟衰老过程中，遭受病害、冷害或其他伤害等逆境胁迫时，细胞中产生的超氧阴离子自由基和羟基自由基，能诱导膜脂中不饱和脂肪酸发生过

氧化作用，产生脂质自由基。脂质自由基可进一步诱发膜脂的过氧化作用，导致细胞膜透性增加，细胞受到损伤或死亡。丙二醛( malondialdehyde , MDA)是膜脂过氧化作用的主要产物之一，通常利用它的含量作为脂质过氧化指标，反映细胞膜脂过氧化的程度。MDA可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或使之产生交联反应，从而丧失生物功能。MDA还可以使纤维素分子间的桥键松弛，或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累能对果蔬细胞质膜和细胞器造成一定的伤害。

在高温、酸性条件下，MDA能与硫代巴比妥酸(TBA)发生反应形成红棕色的三甲基复合物(3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮)，该复合物在波长532nm处有最大光吸收。然而，果蔬组织中存在的可溶性糖类物质对MDA-TBA反应有干扰作用。糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，在532nm处也有光吸收。为消除这种干扰，可用下列经验公式消除由蔗糖引起的误差，

c(umol/L)?6.45?(OD532?OD600)?0.56?OD450

式中OD450、OD532、OD600—分别代表450nm,532nm,600nm波长处的吸光度值。 运用上式可直接求得果蔬组织提取液中的MDA浓度，从而进一步计算出果蔬组织中MDA的含量。

材料、仪器及试剂 (一)材料

黄瓜、香菜等。 (二)仪器及用具

研钵、试管、移液器、恒温水浴锅、离心机、分光光度计、电子天平、离心管。

(三)试剂

1. 100g/L三氯乙酸(TCA)溶液

称取l0g三氯乙酸，用蒸馏水溶解、稀释至100mL。 2. 6.7g/L硫代巴比妥酸(TBA)溶液

称取0.67 g硫代巴比妥酸，用100mL 0.05mol/L NaOH溶液溶解。 实验步骤

称取1.0g果蔬样品，加人5.0mL 100g/L TCA溶液，研磨匀浆后，于4℃,10000 xg离心20min，收集上清液，低温保存备用。

取2. 0mL上清液(对照空白管中加人2. 0mL 100g/L TCA溶液代替提取液)，加人2. 0mL 0. 67% TBA,混合后在沸水浴中煮沸20min，取出冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm,532nm和600nm波长处的吸光度值。重复三次。

实验结果与计算 1.测定数据记录

2.计算结果

根据溶液吸光度值，按照前面的公式计算出反应混合液中丙二醛含量，再按照下式计算出每克果蔬样品(鲜重)中丙二醛的含量，以μmol/g mF表示。计算公式:

式中 c—反应混合液中丙二醛浓度，μmol/L ; V—样品提取液总体积，mL ;

VS—测定时所取样品提取液体积，mL; m—样品质量，g。 注意事项

(1)在测定可溶性糖含量较高果蔬组织中的丙二醛时，测定结果容易受到糖的影响，测定结果甚至出现负值。因此，在具体测定时，需要进行预实验，确定适宜的条件。

(2)测定过程中，需在同一台分光光度计上分别在波长450nm,532nm和600nm处进行测定。

多酚氧化酶（PPO）

基本原理

多酚氧化酶( polyphenol oxidase , PPO)是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。

材料、仪器及试剂 (一)材料

梨、苹果、马铃薯等。 (二)仪器及用具

研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶(100mL,1000mL)。 (三)试剂

1、0. lmol/L、pH 5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液

母液A ( 200mmo1/L醋酸溶液):量取11. 55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000mL。

母液B ( 200mmo1/L醋酸钠溶液):称取16. 4g无水醋酸钠(或称取27. 2g三水合乙酸钠)，用蒸馏水溶解、定容至1000mL。

取68 mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5. 5，加蒸馏水稀释至1000mL。

2、提取缓冲液(含lm MPEG,4% PVPP和1 % Triton X-100)

称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000),4g PVPP(聚乙吡咯烷酮，polyvinyl一poly-pyrrolidone)，取1mL Triton X -100，用0. lmol/L pH 5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。

3、50mmol/L邻苯二酚溶液

称取275 mg邻苯二酚，用0. 1mo1、pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释

至50mL。

实验步骤 (一)酶液制备

称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加人5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃ ,12 000 x g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。 (二)活性测定

取一支试管，加人4.0mL 50mmol/L、pH 5. 5的乙酸-乙酸钠缓冲液和1.0mL 50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加人100 μL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒人比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1 min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。

实验结果与计算 1.测定数据记录 重复次数 样品质量m/g 提取液体积V/mL 吸取样品液体积VS/mL OD0 420nm处吸光度值 OD4 样品中多酚氧化酶活性/(ΔOD420/min?g) OD5 ΔOD 计算值 平均值±标准偏差 OD1 OD2 OD3 1 2 3 2.计算结果 记录反应体系在420nm处的吸光度值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分(从时间I到时间F)计算每分钟吸光度变化值△OD420。

?OD420?OD420F?OD420I

tF?tI 式中△OD420—每分钟反应混合液吸光度变化值; OD420F—反应混合液吸光度终止值; OD420I—反应混合液吸光度初始值; tF—反应终止时间，min; tI—反应初始时间，min。

以每克果蔬样品(鲜重)每分钟吸光度变化值增加1为1个活性单位，单位是 ΔOD420/min·g。计算公式: U??OD420?V

VS?m 式中V—样品提取液总体积，mL ;

VS—测定时所取样品提取液体积，mL; m—样品质量，g。

多酚氧化酶活性还可以每分钟反应体系在波长420nm处吸光度值变化增加1时所需的酶量为1个活性单位，单位是△OD420 /min·mg蛋白质。酶提取液中蛋白质含量可利用考马斯亮蓝染色法进行测定。

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