依次配制浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%的2mlHP-β-CD水溶液。另取藤黄酸0.3g,用8ml无水乙醇溶解,温度控制在50℃~60℃,分别向上述不同浓度的HP-β-CD溶液滴加0.8ml藤黄酸乙醇溶液,即每份溶液中加了30mg的藤黄酸,搅拌反应24小时。反应结束后将反应液倒入小安瓿瓶中,再用少量蒸馏水洗圆底烧瓶,一并倒入小安瓿瓶中,置冰箱中冷冻结冰
2.3藤黄酸成盐后的包合
称取L-精氨酸0.6g于小锥形瓶中,加入4 ml蒸馏水,搅拌溶解后,再分批加入藤黄酸0.12g,使之完全溶解。另取HP-β-CD0.9g、0.6g、0.3g于25 ml圆底烧瓶中,加入2ml蒸馏水使溶解,缓缓滴加上述L-精氨酸的藤黄酸溶液1ml,即HP-β-CD的浓度为30%、20%、10%的溶液,于50℃~60℃水浴中反应8~9小时,反应结束后将反应液转移至小安瓿瓶中,置冰箱中冷冻结冰[2]。
2.4冻干粉中藤黄酸含量测定的研究
2.4.1藤黄酸成盐后最大吸收波长的确定
取藤黄酸盐溶液适量,加甲醇溶解并稀释制成浓度约为10ug/ml,按分光光度法,在200~400 nm波长范围内进行扫描,测定其最大吸收波长为365nm。
2.4.2条件与系统适用性试验
色谱柱:HypersilODSC18色谱柱(4.6mm×250mm,25 μm);
流动相:甲醇-0.1%H3PO4(9∶1);检测波长365 nm;流速1.0 mL·min-1;进样 体积20 μL;柱温为室温。甘露糖衍生物峰理论塔板数计算不低于50000。
2.4.3藤黄酸成盐的标准曲线
配制2ml10%、20%、30%的HP-β-CD溶液,再配制15%的L-精氨酸溶液,使每毫升中含有30mg的藤黄酸,配制成盐。在50~60℃条件下反应8小时[3],在反应过程中缓缓加入上述盐溶液1ml,反应结束将反应液稀释100倍。 2.4.2.4.4黄酸的含量测定
分别取3批号的冻干粉各五份,再用甲醇溶解并稀释成合适的浓度超声3次,每次20分钟[4],进样分析。
2.4.5精密度试验 取一批片剂样品用甲醇稀释并超声后连续进样6次,结果RSD=0.65%。
2.4.6 重现性试验 对同一批片剂样品按2.4.4中的方法重复平行测定5次,RSD=0.91%。
2.4.7 回收率 取样品两份,一份用甲醇稀释并超声3次后定量加入藤黄酸对照品后测定含量,另一份不加对照品测定含量,计算回收率。结果回收率分别为100.67%和98.34%,RSD分别为2.74%和3.22%(n=5)。
2.5冻干粉用生理盐水稀释后藤黄酸体外释放的规律研究
配置质量分数为10%、15%、20%、25%、30%的HP-β-CD的水溶液,分别滴加藤黄酸盐溶液各1毫升(含藤黄酸30毫克),温度控制在50℃~60℃下反应8小时,反应液用生理盐水稀释成200ml之后,在一个半小时内连续进样7针,HPLC分析结果。
第1针进样基本反映出反应的包合率,当HP-β-CD的质量分数大于20%时,包合率达到90%以上,在一个半小时内从HP-β-CD中释放出来的藤黄酸的量不超过25%,并且HP-β-CD的质量分数越大释放得越少。以体外释放情况作为对包合工艺的评价标准,最终确定了包合的优化工艺条件为:HP-β-CD的质量分数为30%,温度50℃~60℃,反应时间8小时。
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