AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄(3)

　　1.5Western印迹

　　按文献报道方法[11]。取各组细胞，PBS洗2遍，加入细胞裂解液，收获蛋白质，4℃，12000r/min，离心15min，Bradford法测定浓度。取适量的蛋白质标本，100g/L丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶上电泳，电压90V 30min，140V 60min。室温恒压100V维持90min。丽春红染色硝酸素纤维膜，观察蛋白转移结果。TBST洗膜：室温下10min。50g/L脱脂奶粉阻断：室温下轻摇60min。TBST洗膜：室温下10min×3次。抗原抗体免疫反应加入TBST稀释的p47phox(1∶500)或GAPDH(1∶1000)抗体孵育：4℃摇床轻摇过夜。TBST洗膜：室温下10min×3次。分别与辣根过氧化物共轭的抗-兔的Ⅱ抗(1∶1000)及HRP-anti-biotin抗体(1∶1000)室温下孵育1h。TBST洗膜：室温下10min×3次。显影、检测ECL发光。室温下将膜浸于发光剂中1min后，取出膜甩去多余液体，将硝酸素纤维膜置于两张干净的保鲜膜之间，在暗室中对着X-线胶片曝光0.5～30min不等。胶片投入自动洗片机中冲洗和烤干。于凝胶成像系统进行目的蛋白及内参照GAPDH条带灰度分析。

　　1.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行分析。吸光度分析采用单位面积计算机图像扫描值减去背景值的均值表示信号强度，以GAPDH作为内参照，计算两者吸光度的比值，并以对照组或0h组作为基准，计算其他各实验组相对吸光度值，以±s表示。组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1大鼠腹膜间皮细胞的鉴定培养的大鼠腹膜间皮细胞呈菱形、椭圆形、多边形等，细胞融合后，呈典型的铺路石样。免疫组化结果示细胞角蛋白(cytokeratin)阳性。在AngⅡ10-7mol/L浓度作用12h后，RPMCs失去原来的整齐排列，细胞间隙增宽，但细胞形态未出现明显的改变(图1)。图1腹膜间皮细胞的形态Fig.1 Morphology of peritoneal mesothelial cells (×200)A：正常大鼠腹膜间皮细胞的形态;B：血管紧张素Ⅱ刺激后大鼠腹膜间皮细胞的形态。

　　2.2AngⅡ对ROS产生的影响及黄芪的干预作用激光共聚焦显微镜观察DCF荧光强度代表ROS产生的量。正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)，在DCF孵育20min后，ROS的产生情况如图所示(图2)。统计学分析，腹膜间皮细胞经AngⅡ刺激20min后，ROS产生较A组显著增加(P<0.05)。C组、D组均可显著逆转由AngⅡ刺激诱导的ROS产生增加，与B组比较，均差异显著(P<0.05)。C组与D组相比较差异显著(P<0.05)，说明ROS产生的量与AGI的浓度呈负相关(图3)。图2激光共聚焦显微镜DCF荧光Fig.2 DCF fluorescent model under laser confocal microscopeA：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)。图3AngⅡ对ROS产生的影响及黄芪的干预作用Fig.3 Angiotensin Ⅱ influenced ROS production and effect of astragalus intervention (n=4)A：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)组。A vs. B，P<0.05;B vs. C，P<0.05;B vs. D，P<0.05;C vs. D, P<0.05。

　　2.3AngⅡ对NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用实时定量RT-PCR结果显示，AngⅡ可诱导NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达上调，且以时间依赖模式上调，p47phox mRNA从4h开始有统计学差异(P<0.05)，至12h到达峰值(图4)。Western blot结果显示，AngⅡ可诱导p47phox蛋白表达以时间依赖模式上调，从12h开始有统计学差异(P<0.05)，至48h达峰(图5)。图4AngⅡ诱导NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA的表达情况Fig.4 Ang Ⅱ induced NADPH oxidase subunits p47phox mRNA expression (n=4)4、8、12、24h vs. 0h，P<0.05。　　图5AngⅡ诱导NADPH氧化酶亚基p47phox蛋白的表达情况Fig.5 Ang Ⅱ induced NADPH oxidase subunits p47phox protein expression (n=4)　　12、24、48、72h vs. 0h，P<0.05。PMCs经AGI预处理后，再行AngⅡ体外刺激，可显著逆转由AngⅡ诱导的NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达上调，C组、D组分别与B组比较，具有显著差异(P<0.05)，但未观察到C组与D组有显著性差异，AGI对p47phox mRNA表达的抑制度不依赖浓度模式(图6)。图6AGI预处理可显著逆转AngⅡ诱导的NADPH氧化酶亚基p47phox mRNA表达的上调Fig.6 AGI pretreatment could reverse Ang Ⅱ’s induction of NADPH oxidase subunits p47phox mRNA expression(n=4)A：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)组;A vs. B，P<0.05;B vs. C，P<0.05;B vs. D，P<0.05。

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