僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究(2)

　　1  实验材料

　　Waters 515 HPLC系统(Waters 公司)；BS100A自动部分收集系统(上海市沪西仪器厂)；Start-4半自动四通道血凝仪(法国STAGO公司)；4300-Pro紫外分光光度计(瑞士安玛西亚公司)；HR2838型匀浆机(菲力普公司)；LP115 pH计(METTER TOLEDO公司)；DDS-ⅡA电导率仪(上海理达仪器厂)；移液枪(0.1 mL和1.0 mL,日本)；半微量凯氏定氮装置；Z-16和Z-26层析柱(上海化学仪器厂)。制僵蚕(购自湖南振兴中药饮片有限公司)；葡聚糖凝胶(Biotech公司)；凝血酶试剂(上海太阳生物技术公司,批号N25006)；兔血浆(自制)；15种氨基酸对照品(Sigma公司)；水为超纯水；甲醇(色谱纯)、三氟乙酸(THF)、2-巯基乙醇、邻苯二甲醛(OPA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等化学试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  样品溶液的制备
   
　　称取制僵蚕1 500 g(样品A),用8倍量水浸泡过夜,以3 000 r/min匀浆,然后煎煮2次,每次30 min,过滤,合并滤液,离心,得提取液8 450 mL(样品B),将其浓缩至含原药材2 g/mL,加无水乙醇浓度至60%,4 ℃放置过夜,3 000 r/min离心,取上清液水浴浓缩至含原药材约6 g/mL,即得粗提液240 mL(样品C)。将30 mL该液加到用0.05 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶柱(φ2.6 cm×80 cm)上,用相同缓冲液洗脱,自动分步收集器收集,2.5 mL/ (10 min·管),每2～3管按文献方法[8]测定凝血酶时间(TT,s)、紫外吸收光谱,用重量法测定质量百分浓度(m/v)、电导率仪测定溶液电导率,得洗脱曲线(见图1)。将TT在40～100 s之间的组分合并得洗脱液69 mL(样品D),TT≥100 s的组分合并得洗脱液82.5 mL(样品E),E即为抗凝活性部位。

　　图1表明, 紫外吸收光谱法(UV)检测的最强色谱峰的前半部分为具有抗凝活性的部位,与UV法测得的G-25凝胶色谱峰值不重合,而按质量百分浓度(M/V)和电导率法测得的色谱峰值与抗凝活性峰值基本重合。

　　2.2  抗凝活性部位的化学成分理化鉴别

　　2.2.1  茚三酮反应、pH值、电导率、AgNO3/HNO3反应和CaCl2/HNO3反应  分别取B～E样品溶液进行理化测定,结果表明,僵蚕提取分离后的B～E样品所检测的理化性质结果一致,提示所含主要成分基本相同。茚三酮反应阳性,活性部分电导很大,与AgNO3产生白色沉淀,滴加HNO3后沉淀部分溶解,与CaCl2产生沉淀,滴加HNO3沉淀溶解。提示抗凝活性成分可能是盐类(如氯化物、草酸盐等)、蛋白质、肽类或其它含氨基酸的化合物。

　　2.2.2  紫外吸收光谱 

　　取各样品稀释适当后在200～400 nm扫描,其紫外吸收光谱见图2。

　　图2表明,样品B～E的UV光谱形状均不相同,表明提取分离所得样品化学成分有所不同。提取分离后除去了大量的无活性物质,特别是经过凝胶色谱纯化后,UV光谱变化较大。

　　2.2.3  样品E的凝胶色谱分析及其分子量分析 

　　取样品E中TT≥600 s的馏分2 mL上Sephadex G-15(φ1.6 cm×50 cm)柱,用水洗脱盐,4.0 mL/(10 min·管),自动分步收集器收集,测定各管的TT值、260 nm和280 nm处的吸光度及化学反应特性,结果见表1。表1  TT≥600 s馏分的凝胶柱脱盐中馏分的抗凝活性和理化特性检
测结果（略）注：*必要时,通过稀释馏分,测定吸光度在0.2～0.8之间,计算而得

　　2.3  定量分析

　　2.3.1  固形物含量测定 

　　精密吸取样品B～E各2.0 mL,80 ℃下烘至近干,100 ℃下烘至恒重,精密称定,按每1 mL样品溶液扣除5.0 mg的Tris和NaCl重量,得固形物重量和浓度(各样品均为n＝3,RSD不超过0.8%),结果见表2。表2  僵蚕各部位中的固形物和蛋白质测定结果（略）注：*与样品A比

　　2.3.2  指标检测 

百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说医药类僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究(2)在线全文阅读。