2.2 超滤及其预处理浸提液在超滤前用0.45 μm微滤膜除去粗提液中的固形物以降低对超滤膜的污染。控制超滤压力为0.08 MPa，将蒲公英多糖的浸提液先用孔径10 KDa的超滤膜进行超滤处理。滤过液继续采用6KDa的超滤膜进行超滤处理，分别测定10 KDa超滤膜的截留液、6 KDa超滤膜的截留液、6 KDa超滤膜的滤过液中的总糖、还原糖含量，计算各部分多糖含量，分析蒲公英多糖的大致分子量分布情况。图1显示了各部分的比例和含量。
2.3 多糖含量的测定总糖含量的测定采用蒽酮－浓硫酸法［4］；还原糖含量的测定采用3,5－二硝基水杨酸比色法［4，5］。
多糖含量=总糖含量-还原糖含量［6］
2.4 蛋白含量的检测蒲公英粗多糖溶液经木瓜蛋白酶和三氯乙酸（TCA）脱蛋白后，测定其在260 nm和280 nm处的吸光值［7］。
2.5 多糖清除·OH的测定清除·OH试验的方法：采用Fenton反应体系［8］。清除率E(%)计算公式为：
E(%)=［A0－(Ax－Ai)/A0 ］×100%
式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入多糖溶液后的吸光度；Ai为不加显色剂H2O2 多糖溶液的本底的吸光度。
2.6 多糖清除O2-·的测定多糖清除O2-·的试验采用邻苯三酚自氧化法［9］。清除率E(%)计算公式为：
E(%)=(A对照－A样品)/(A对照－A空白)
式中：A空白空白组的吸光度；A对照为对照组的吸光度；A样品为多糖液的吸光度。
3 结果
3.1 蒲公英多糖的分子量分布称取30 g蒲公英根粉末加入30倍的水80℃浸提两次，3 h/次。浸提液经抽滤后加水定容至1 500 ml。浸提液中总糖含量为2.14 mg/ml,还原糖的含量为0.31 mg/ml,多糖含量为1.83 mg/ml。根据上述超滤方法得到蒲公英多糖不同组分多糖分布如图1所示。
由图1可知，蒲公英多糖分子量大于10 KDa(DP1)占蒲公英多糖的35.50%，分子量在6 KDa与10 KDa之间(DP2)占蒲公英多糖的53.71%，而分子量小于6 KDa(DP3)只占蒲公英多糖的10.79%。本实验采用多糖分布量较大两个部分DP1 、DP2继续研究它们的清除自由基的活性，DP1 、DP2经木瓜蛋白酶和TCA脱蛋白后在260 nm和280 nm处检测无明显吸收。
3.2 蒲公英多糖清除·OH的作用分别配5 mg/ml DP1、DP2溶液，根据Fenton反应，其对·OH的清除率见表1及图2。由表1、图2可知，蒲公英多糖DP1、 DP2对·OH有清除作用，并随着多糖加入量的增加清除率上升，即清除率与多糖的用量之间存在一定的量-效关系。其中DP2的清除率高于DP1，当浓度达到5 mg/ml时 DP2的清除率达到61.21%而DP1为49.78%。表1 不同组分多糖对·OH的清除率（略）
3.3 蒲公英多糖清除O2-·的作用根据邻苯三酚自氧化法，蒲公英多糖DP1、DP2清除O2-·的作用见表2、图3所示。表2 不同组分多糖对O2-·的清除率（略）
由表2、图3可知，蒲公英多糖DP1、 DP2对O2-·具有一定的清除作用，并随着用量的增加清除率逐渐上升但清除能力不如对·OH明显。这两个组分中DP1的清除能力略高于DP2，当浓度达到2.5 mg/ml的时DP1清除率为14.65%略高于DP2的13.14%。
4 结论
目前人们已经提出各种学说来解释机体的衰老、疾病等生理现象，如自由基学说、免疫功能下降学说、生物膜衰老学说、代谢失调学说等，其中被人们普遍接受的是氧自由基学说，最能解释机体衰老、生病的机理。研究表明，毒性氧离子包括O2-·，H2O2·OH等，这些毒性氧自由基能够使细胞膜脂质过氧化，增强细胞膜通透性，使细胞内容物流出，同时还损伤蛋白质和DNA。本文通过对蒲公英粗多糖超滤分离后，可得到3个组分即DP1、DP2H DP3，其中DP2多糖含量最高，占蒲公英多糖含量的53.71%，对两个含多糖较多的主要组分DP1和DP2清除羟自由基和超氧阴离子的能力进行了初步研究，显示两组分均能清除羟自由基和超氧阴离子，且在本实验范围内随多糖浓度的升高，清除能力逐渐加强。其中对羟自由基的清除能力DP2高于DP1，在5 mg/ml时达到61.21%，对羟自由基产生明显的抑制作用。而对超氧阴离子的清除能力DP1略高于DP2。从总体的清除效果看，二者对羟自由基有较强的清除能力。本实验为蒲公英多糖对人机体的作用提供了间接的依据，为蒲公英多糖的分离纯化及蒲公英多糖生物活性的研究提供基础资料。
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