扇贝多肽经SmacXIAP通路抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡的作用

                        作者：张兰兰 苏爱 刘颖 孙谧 王春波 杜卫 

【摘要】  目的 探讨扇贝多肽（PCF)经半胱天冬酶激活物(Smac）和X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)通路对抑制中波紫外线（UVB）诱导HaCaT细胞凋亡的分子机制。方法 实验分为如下6组：正常对照组（A组）、UVB模型组（B组）、UVB+1.42 mmol/L PCF组（C组）、UVB+2.84 mmol/L PCF组（D组）、UVB+5.68 mmol/L PCF组（E组）和UVB+5.68 mmol/L维生素C阳性对照组（F组），分别进行相应处理。分别采用琼脂糖凝胶电泳和Hochst 33258染色法测定各组细胞凋亡率，蛋白印迹法（Western blot）检测胞浆内Smac的水平，RT?PCR检测XIAP mRNA表达。结果 B组与A组比较，细胞凋亡率显著降低（F=165.096,q=36.535,P<0.01)，胞浆Smac明显增加（F=174.311,q=33.106,P<0.01)，XIAP mRNA表达显著减少（F=97.141，q=26.147,P<0.01)；预先加入药物各组（C、D、E、F组）与B组相比，细胞凋亡率降低（q=11.369～28.592,P<0.01)；C、D、E组与B组相比较，胞浆Smac含量明显降低（q=9.191～26.180,P<0.01)，XIAP表达增加（q=8.073～17.618,P<0.01)。且随着PCF浓度的增加，细胞凋亡率降低（q=7.259～9.965,P<0.01)，胞浆Smac含量降低（q=6.926～10.063，P<0.01)，XIAP表达增加（q=3.706～5.839,P<0.05)。结论 PCF在1.42 ～5.68 mmol/L浓度范围内可呈剂量依赖性地抑制Smac从线粒体释放到胞浆，上调XIAP mRNA 的表达，抑制caspase?3的活化，从而抑制UVB诱导的HaCaT细胞凋亡。 
【关键词】  细胞凋亡；紫外线；信号传导；分子作用机制
中波紫外线（UVB）辐射能诱导HaCaT细胞发生凋亡[1]，长期过度的照射可导致皮肤癌的发生，严重危害人类的健康。目前，人们广泛应用人工合成抗氧化剂防护紫外线损伤，但人工合成抗氧化剂多为大分子蛋白或糖肽，不易被人体吸收。扇贝多肽（PCF)是自海洋贝类栉孔扇贝废弃物中提取的水溶性小分子多肽, 属于海洋抗氧化剂。我们以往的研究表明, PCF可有效地保护人真皮成纤维细胞对抗UVB的辐射损伤[2]。近期研究显示，线粒体内包含一些与细胞凋亡密切相关的物质，如半胱天冬酶原、细胞色素、半胱天冬酶激活物(Smac）、凋亡诱导因子等，在凋亡刺激因素（UV）的作用下，线粒体膜的通透性增加，凋亡相关物质释放出线粒体，诱导细胞凋亡。已有研究结果证实，Smac和X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)参与了大鼠脑外伤或脑缺血引起的神经元凋亡机制[3]。更有研究显示，转染XIAP、Smac的野生型NT2细胞经25 J/m2紫外线照射后，Smac释放入胞浆与胞浆内XIAP结合，且细胞凋亡显著增加[4]。本研究以HaCaT细胞为研究对象，复制UVB辐射损伤HaCaT细胞凋亡模型，从线粒体内源性凋亡通路Smac?XIAP?caspase?3探讨PCF对UVB辐射HaCaT细胞的保护作用及其机制。
　　1  材料和方法 
　　1.1  试剂与仪器
　　1.1.1  试剂  完全培养基，由DMEM (Gibco公司)、体积分数为0.10的标准胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）、100 kU/L青霉素和100 kU/L链霉素组成；PCF由中国水产科学研究院黄海水产研究所分离纯化，纯度>96%，蒸馏水配制成227.5 mmol/L的储存液，过滤除菌，4 ℃保存备用；DNA Ladder抽提试剂盒、Hoechst 33258染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；RNAiso Reagent、逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；Smac 抗体购自eBioscience；XIAP抗体购自Cell Signaling Technology TM(Beverly, MA, USA)；caspase?3和?9 抗体购自北京博奥森公司。 XIAP和GAPDH引物由北京三博远志生物技术有限公司合成；预染蛋白质相对分子质量标准、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；β?actin 抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

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