脑和脊髓损伤对骨折股骨骨痂中NGF表达影响(2)

    1  材料与方法

    1.1  动物分组

    成年健康雌性Wistar大鼠48只，8月龄，体质量290~340 g，清洁级，由同济医科大学动物中心提供。随机分为单纯股骨骨折组16只、股骨骨折并脑损伤组16只和股骨骨折并脊髓损伤组16只，每组再分为骨折后1、4、7和14 d等4个观察组，每组4只大鼠。

    1.2  动物模型的建立

    应用自由坠落重物撞击法建立脑或脊髓损伤动物模型［1］。1期郭静芹，徐进亮，梁爱琴，等脑和脊髓损伤对骨折股骨骨痂中NGF表达影响35

    1.2.1  单纯股骨骨折组  将大鼠用100 g/L的水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。常规消毒，无菌操作，取股外侧纵行切开1 cm，经股前、外侧肌间隔分离至股骨，用线锯切断股骨中段，然后行克氏针髓腔逆行固定，逐层缝合切口，消毒包扎。术后放置笼中，常规饲养，自由活动与取食。

    1.2.2  股骨骨折并脑损伤组  完成上述手术后，在颅顶沿正中线切开皮肤，显露右顶骨，于中线旁2 mm处用骨钻钻开直径5   mm骨窗，暴露硬脑膜。将动物置于重力打击装置下，用质量20 g的金属砝码于30 cm高处，通过玻璃导向管自由坠落，撞击置于硬脑膜上的圆柱形撞击杆，造成中度脑损伤。迅速移开打击装置，逐层缝合切口，消毒包扎。其中有3只大鼠撞击后当场死亡，死亡的大鼠再补齐。术后放置笼中，每8 h挤尿1次，常规饲养，自由活动与取食。

    1.2.3  股骨骨折并脊髓损伤组  完成股骨骨折手术后，于动物背部常规消毒，无菌操作，纵行切开皮肤及皮下组织，剥离棘突旁肌肉，切除第7胸椎棘突及椎板，暴露硬脊膜。将动物置于重力打击装置下，用质量20 g的金属砝码于5 cm高处，通过玻璃导向管自由坠落，撞击置于硬脊膜上的圆柱形撞击杆，造成中度脊髓损伤。迅速移开打击装置，逐层缝合切口，消毒包扎。应用改良Tarlov评分法测评大鼠后肢运动功能状况［2］。

    1.3  标本采集和切片制备

    各组动物在规定的观察时间点分批麻醉后，经左心室依次灌注生理盐水200 mL和40 g/L多聚甲醛300 mL。立即在无菌操作下，沿骨折部位上、下各1 cm处用线锯截取股骨，置于40 g/L多聚甲醛中后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h，然后放入质量分数为0.20乙二胺四乙酸二钠中3~4周，充分脱钙（以用针头能轻易扎穿骨皮质为宜）。修剪股骨标本长约1 cm，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，沿股骨长轴纵行连续切片，片厚7 μm，粘于多聚赖氨酸处理的切片上，置4 ℃冰箱中备用。

    1.4  苏木精伊红染色切片染色后，细胞核呈蓝色，细胞浆呈淡红色。

    1.5  免疫组织化学染色

    兔抗鼠NGF多克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。按照试剂盒说明操作，DAB显色，观察骨痂组织成骨细胞及纤维母细胞内NGF表达情况，细胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。阴性对照以0.1 mmol/L的PBS代替一抗，不出现阳性着色。

    1.6  阳性细胞数和吸光度的检测

    每个标本在高倍镜（400倍）下随机观察骨痂处4个不重叠的视野，应用WIDAS21图像分析系统计算每个视野阳性细胞数。

    2  结    果

    2.1  组织学观察

    2.1.1  单纯骨折组  表现为典型的骨折愈合过程，骨痂呈梭形向外膨胀，骨膜反应轻，纤维骨痂量少，膜内成骨和软骨内成骨并存，以前者为主。骨折第4天骨膜开始增厚，骨膜内形成的软骨细胞及纤维母细胞的量逐渐增多。随着时间的延长，成骨细胞增多，骨痂层逐渐增厚，至骨折第14天已形成典型的骨小梁结构。

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