生物工程实验指导2010(7)

1.将50 mL发酵液进行离心，6000rpm，10min，收集沉淀用2.5mM磷酸钾缓冲液洗涤2次，离心收集菌体。

2. 用2.5mM磷酸钾缓冲液15mL将菌体重悬，超声破碎细菌至细菌悬液变的清亮透明。8000 rpm，10min，上清即为SOD粗酶液（留样1mL测酶活和蛋白含量）。

3. 向上清中缓慢加入在 4 ℃下预冷过的95% 乙醇 125mL(0.25 倍体积 ), 然后再缓慢加入在4℃下预冷过的氯仿75mL(0.15倍体积),充分搅拌, 室温下 600O rpm，10min, 弃去沉淀, 收集上清液约 12mL(留样0.5mL测酶活和蛋白含量)。

4.加入K2HP04 ·3H20(按43g k2HP04·3H20/100mL粗提液的比例), 转移到分液漏斗,振摇后静置5min,见分层明显。收集上层乙醇-氯仿相(微混浊), 室温下离心6000rpm，10min, 弃去沉淀, 得上清液约8mL(留样0.5mL测酶活和蛋白含量 ) 。

5.向上一步得到的上清液加入0.75 倍体积在4℃下预冷过的丙酮 , Mn-SOD 便沉淀下来。室温下离心6000rpm，10min, 收集灰白色沉淀物。将此灰白色沉淀物溶于约3mL重蒸水中(呈悬浮状),在4℃下, 对250mLpH7.6,2.5mmol/L的磷酸钾缓冲液透析,每隔0.5h 以上, 换透析外液1次, 共换 2-3 次。透析内液如出现沉淀, 需在室温下6000rpm，10min,弃去沉淀,收集上清液约5ml(留样 0.3mL) 。 6.DE-52 纤维素柱层析

DE-52 纤维素的处理: 称量DE-32 纤维素干品5-6g用自来水浮选除去 1-2min不下沉

的细小颗粒, 用G3烧结漏斗抽干, 滤饼放人烧杯中,加适量lmol/L NaOH 溶液, 搅匀后放置15min, 用G3烧结漏斗抽滤,水洗至中性,滤饼悬浮于l mol/L HCl溶液中, 搅匀后放置lOmin后用 G3 烧结漏斗抽滤,水洗至中性,滤饼再悬浮于1mol/L NaOH 溶液中,抽滤, 水洗至中性,最后将滤饼悬浮于层析柱平衡缓冲液中待用。DE-32 纤维素使用后的回收处理与上述步骤相同 , 只是不用 HCl 所用 NaOH ，浓度改为 0.5mol/L 。

将上一步所得离心上清液过 DE-32 纤维素柱。柱体 1.O × 10cm, 用 pH7.6,2.5mmol/L磷酸钾缓冲液作层析柱

平衡液, 用

pH7.6,25mmol/L(100mL)-200mmol/L(l00mL) 的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。流速 30mL/h, 每管收集3mL ,记录总体积。 .

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实验二 超氧化物歧化酶蛋白浓度和酶活性的测定

一 目的要求

掌握蛋白含量和SOD酶活性的测定方法。 二、原理

根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的活性单位来表示，因此，测定样品的比活性必须测定：（1）每毫升样品中的蛋白质毫克数。（2）每毫升样品中的酶活性单位数。

超氧化物歧化酶活性的测定方法较多,常采用邻苯三酚 ((HO)3C6H81,2,3- benzenetriol)自氧化法。邻苯三酚自氧化的机理极为复杂, 它在碱性条件下, 能迅速自氧化,释放出 O2-, 生成带色的中间产物。反应开始后, 反应液先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段, 中间物的积累在滞留30-45s后, 与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min 的范围内。中间物在420nm波长处有强烈光吸收, 当有SOD存在时, 由于它能催化O2与 H 结合生成02和H202, 从而阻止了中间物的积累, 因此,通过计算就可求出SOD的酶活性。

邻苯三酚自氧化速率受pH, 浓度和温度的影响, 其中pH 影响尤甚, 因此, 测定时要求

-+

对pH严格掌握。现试剂公司开发的SOD试剂盒使用较方便，灵敏度高。

测定蛋白质含量可用卡马斯亮蓝法，该方法灵敏度高，操作简便。 三、试剂

pH8.的100mmol/L Tris -二甲胂酸钠缓冲液(内含2 m mol/L)二乙基三氨五乙酸)， 10m mol/L HCL，6mmol/L连苯三酚，卡马斯亮蓝G250，标准蛋白等等。 四、操作

1.卡马斯亮蓝法测蛋白

（1）取 7只试管，编号，按下表操作： 各阶段样品（毫升） 蒸馏水 标准蛋白溶液1g/L（毫升） G250（毫升） 立即混匀，室温放置2-3分钟，595nm比色，空白管调零。 （2）计算出各阶段样品的蛋白浓度。

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1 0.1 2 0.2 3 0.2 4 0.3 5 0.5 标准 空白 0.4 0.3 0.3 0.2 0.4 0.1 0.5 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

2.酶活性的测定

（1） 邻苯三酚自氧化速率的测定

在试管中按表 441 加入缓冲液和重蒸水 ,25 ℃下保温 20min, 然后加入25 ℃预热过

的邻苯三酚(对照管用10mmol/L HC1 代替邻苯三酚), 迅速摇匀, 立即倾人比色杯中, 在420nm 波长处测定A值, 每隔30s读数一次, 要求自氧化速率控制在0.06OA/mn( 可增减邻苯三酚的加人量, 使速率正好是 0.06OA/min) 。

（2） 酶活性的测定

酶活性的测定按表2加样 , 操作与测定邻苯三酚自氧化速率相同。根据酶活性情况可适当增减酶样品的加入量。

酶活性单位的定义: 在lmL反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50% 时的酶

量定义为一个活性单位,即在420nm波长处测定时,0.03OA/min 为一个活性单位。若每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率在35-65%范围,通常可按比例计算,若数值不在此范围时,应增减样品加入量。

表1 领苯三酚自氧化速度测定加样表

试 剂 pH8.的100mmol/L Tris -二甲胂酸钠缓冲液(内含2 m mol/L)二乙基三氨五乙酸) 重蒸水 10m mol/L HCL 6mmol/L连苯三酚 总体积

（3） 活性和比活的计算公式

每毫升酶液活性单位（U/mL）=

X反应液总体积 X

总活性（U）=每毫升酶液活性单位(U/mL)X 酶原液总体积

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对照管/mL 样品管/mL 最终浓度/(m mol/L) 50,Ph8.2 Tris-二甲胂酸4.5 4.5 钠缓冲液(内含1 m mol/L)二乙基三氨五乙酸) 4.2 0.3 - 9 4.2 - 0.3 9 - - 0.2 - 0.060―酶样品管自氧化速率 0.060 50% 酶样品液稀释倍数 X100% 酶样品液体积

每毫升酶液活性单位(U/mL) 比活= = 总活性单位数(U)

表2 酶活性测定加样表

试 剂 pH8.2 100mmol/L Tris-二甲胂酸钠缓冲液(内含2 m mol/L)二乙基三氨五乙酸) 酶溶液 重蒸水 6mmol/L连苯三酚 10mmol/L HCL 总体积 思考题

1. 超氧化物歧化酶对人体有何生物学意义 ?

2. 有机溶剂能沉淀超氧化物歧化酶所根据的原理是什么 ?

- 4.2 - 0.3 9 0.1 4.1 0.3 - 9 4.5 4.5 对照管/mL 样品管/mL 最终浓度/(mmol/L) 50mmol/L, PH8.2 Tris-二甲胂酸钠缓冲液(含1mmol/L)二乙基三氨基五乙酸 - - 0.2 - - 每毫升蛋白浓度(mg/ mL) 总蛋白(mg)

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实验三 超氧化物歧化酶活性染色鉴定法

一 目的要求

(1) 学习超氧化酶歧化酶活性染色原理。

(2) 掌握超氧化物歧化酶活性染色技术，对纯化方案进行评价。 二 原理

超氧化物阴离子自由基能对氯化硝基四氮略蓝 ( 简称 NBT) 进行光化还原 , 生成紫

--+

色的甲滕(formazan)。SOD 能催化下列反应:02+02+2H→H202+02

所以当反应系统中存在SOD时, 便促使超氧化物阴离子自由基02- 形成过氧化氢 , 从而抑NBT 的光化还原, 也就是抑制了蓝紫色甲腾生成。

当用 PAGE分离SOD后, 将凝胶板浸泡在NBT溶液中,先进行暗反应,再经光照 , 此步处理后, 除含SOD的部位之外, 其余凝胶板背景则变成蓝紫色, 也就是在一片蓝紫色背景的凝胶中出现缺色的含SOD的明亮区带。此过程称为SOD的活性染色。这一技术对鉴定SOD 活性的存在具有重要的实践意义。 一、试剂

1.SOD纯品

称少许锰 SOD ( 电泳纯 ) 按 lmg/lmL 的比例 , 将其溶解在蒸馏水中。 2. 2.45 × 10mol/L NBT 溶液

称 20Omg NBT 使其溶于蒸馏水中并定容至100mL, 置棕色试剂瓶中,4 ℃贮存。由NBT溶液用量较多, 且NBT价格贵, 每次用后妥善保存, 可反复使用多次。当黄色NBT溶液变浅或变绿并出现沉淀时则不能继续应用,应重新配制。 3. 3.60 × 10-2mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液

内含2.8×10-2mol/LTEMED和2.8×10-5mol/L核黄素, 在l00mL3.60×10-2mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液中含0.42mL TEMED 及 1.32mg 核黄素。置棕色瓶中,4 oC贮存。

4. 5 × 10-2mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液 100mL 5. 卡马斯亮蓝R250 6. 脱色液 二、器材

夹心式垂直板电泳槽, 电泳仪 (300-600V,50-l00mA), 吸量管(2,5,10mL), 烧杯(25,50,l00mL), 细长头滴管, 微量注射器 (10 μ L 或 50 μL) 培养皿 ( 直径12cm),4 × 8W 日光灯。 三、操作

1. 安装垂直板电泳槽 , 2. 配胶及灌胶

配制10%PAA 分离胶, 及3.75%PAA 浓缩胶。待浓缩胶完全聚合后, 老化30min, 小心取出样品槽模板,用窄滤纸条吸去多余溶液 ,加人pH8.3Tris-HCl电极缓冲液。

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