7.5% 6ml H2O 30%凝胶贮存液 4×分离胶缓冲液（pH8.8） 10%过硫酸铵 TEMED 3ml 1.5ml 1.5ml 60μl 3μl 10% 6ml 2.5ml 2ml 1.5ml 60μl 2.5μl 12% 6ml 2.1ml 2.4ml 1.5ml 60μl 2μl 15% 6ml 1.5ml 3ml 1.5ml 60μl 1.5μl 加入TEMED后立即混匀，小心灌入玻璃板夹层中，（胶顶距离Teflon梳子5mm左右），然后用100μl正于醇封顶，保持胶面平整。
3、灌浓缩胶：
待分离胶凝固后，倒出正丁醇和析出的水相，灌入浓缩胶，插好Teflon梳子。
4.5% 4ml H2O 30%凝胶贮存液 4×分离胶缓冲液 1ml （pH8.8） 10%过硫酸铵 TEMED 4、样品处理：
蛋白样品加入等体积的2×蛋白上样缓冲液，沸水浴5-10分钟（冷却后上样） 5、上样：
在电泳槽中加入1×PAGE电泳缓冲液，小心拔出梳子，上样10-20μl. 6、电泳：
起始用低电压8V/cm（约60V），当溴酚兰前沿进入分离胶后，电压提高位15V/cm（约120V），直到溴酚兰泳到胶底为止。关闭电泳仪。
7、剥胶：
40μl 4μl 20μl 2μl 0.5ml 2.4ml 0.6ml 2ml 1.2ml 0.3ml 4.5% 16
取出玻璃板，小心撬开，切除封底胶和浓缩胶，切去左右上角作记号。 8、染色和脱色：
将凝胶浸泡在染色液中，振荡染色1-2小时，有时可根据染色液质量，染色过夜。然后换脱色液，洗至背景干净、条带清晰为止。
9、染色和脱色：
拍照或用干胶机干胶保存。 注意：
1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的有效分离范围
丙烯酰胺浓度（%） 15 10 7.5 5.0 线性分离范围（KD） 12-43 16-68 36-94 57-212 2、宿主菌都有其自身的蛋白质，表达的产物在SDS-PAGE电泳时，其分子量可能会与宿主菌的蛋白质条带重叠，给分析结果带来麻烦，遇到这种情况。一般采用以下几种办法来处理：①比较表达结果与对照结果中各条蛋白带的浓度，并选择几条肉眼看到浓度无差别的蛋白带为比较对照，寻找表达结果中是否有浓度增加的蛋白条带。如果有，则可进一步分析；②改变电泳胶的浓度（调整电泳胶的有效分辨范围），使蛋白重叠条带分开；③SDS-PAGE转膜后用抗血清或抗体做免疫western Blot（免疫印迹实验），观察表达结果中是否有特异性条带出现。
3、影响蛋白电泳的因素有：①样品的盐浓度；②SDS的质量；③缓冲液的pH值不准；④上样孔的不平整。必要是，可在拔出Teflon梳子后冲洗上样孔，以防止残留的丙烯酰胺再凝聚，造成上样孔的不平齐。
17
实验四 重组蛋白纯化：可溶性His Tag-蛋白的抽提
一、实验原理
一般在大肠杆菌高效表达真核基因时，所产生的产物常以包涵体的形式存在，用超声仪破裂细菌后进行离心，表达产物存在于离心管底，而不在上清液内，因此当上清液内分析不到样品时，应考虑分析离心沉淀物，最好是第一次分析所表达的产物时，将两者同时进行电泳分析，以确定表达产物在宿主菌内的存在形式。包涵体产物一般不能直接用于常规层析方法进行纯化，必须用盐酸服等非离子型强变性剂溶解，并用不同的方法待产物复性后才能进行常规分离纯化，否则会给后期实验带来不便。
原核表达系统表达基因，其产物在宿主中的存在形式并不是固定不变的，随培养基的营养状况、诱导培养的时间和表达效果的高低而不同。如果能将表达产物变成可溶性形式，将有昨于后续实验的快速开展，表达菌培养时，营养状况好、诱导表达时间短、表达效率降低都有利于可溶性表达产物的形成。
pET28原核表达系统的表达产物C末端均融合带有His Tag序列蛋白，据此可用Novagen的His.Binda系列树脂和剂盒来纯化，其原理是通过固定化金属亲和层析（IMAC）来快速一步纯化His-Tag序列蛋白。His.Tag序列（6、8或10个连续的组氨酸残基）与固定在NTA-或IDA-的His.Bind树脂上的二阶阳离子Ni结合，洗去未结合蛋白后，用咪唑或稍低pH的洗脱液进行洗脱，从而回收目标蛋白。也可用于6M胍或尿素变性法溶解的包涵体蛋白。
二、试剂与材料
1、细菌诱导表达实验的所有器材 2、10mg/ml溶菌酶 3、10%Triton X-100
4、制冰机、高速离心机、超声波仪
5、Novagen公司的NTA-His.Binda树脂和试剂盒 6、SDS-PAGE实验的所有器材 三、操作： 1、样品准备
（1）准备细菌，接种，诱导表达。[IPTG]：lmM；37℃（或低温：30℃、24℃等）；3
2+
18
小时或更长时间（如过夜）。
（2）冰上冷却后离心，收集细菌，加入1/20细菌生长体积的NTA-0 Buffer，重悬；加10mg/ml溶菌酶（终浓度0.3mg/ml），冰上放置30分钟，超声破碎细菌。
（3）加入10%Triton X-100(终浓度0.1%)，混匀，冰上放置15分钟，视具体情况可再次超破碎。
（4）13000rpm，离心10分钟，取上清置于冰上，准备纯化。 2、纯化
（1）将NTA树脂（一般为1ml）装入层析柱，用NTA-0 Buffer洗去乙醇。
（2）将上述的上清加到NTA层析柱中，可收集流出成分，用于SDS-PAGE分析蛋白的结合情况。
（3）用NTA-0 Buffer洗4-5次（视具体情况而定），每次1ml，洗去杂蛋白。 （4）用NTA-40 Buffer洗2次，每次1ml，其中会含有目的蛋白和杂蛋白。 （5）用NTA-100 Buffer洗4次，每次500ul，主要含有目的蛋白。 （6）用NTA-200 Buffer洗4次，每次500ul，主要含有目的蛋白。 （7）用NTA-1000 Buffer洗2次，每次500ul，主要含有目的蛋白。 3、分析
每次都要收集流出成分，取100ul样品进行SDS-PAGE分析，选取杂蛋白最少，目的蛋白最多的样品进行以后的实验。
注意：对于不同的可溶性蛋白，进行纯化的洗涤Buffer和洗脱Buffer均不同，所以在条件允许时可以用含有不同咪唑浓度的Buffer进行实验，选择最佳洗涤和洗脱条件进行纯化蛋白。
附：
NTA Buffer溶液配方
NTA-0 Buffer：20mM Tris-HCI pH7.9, 1M NaCl,10%Glycerol.
NTA-40 Buffer:20mM Tris-HCI pH7.9,1M NaCl,10%Glycerol,40mM Imidazole. NTA-100 Buffer:20mM Tris-HCI pH7.9,1m NaCl,10%Glycerol.100mM lmidazole. NTA-200 Buffer:20mM Tris-HCI pH7.9, 1M NaCl,10%Glycerol,200mM Imidazole.
19
NTA-1000 Buffer： 20mM Tris-HCI pH7.9,1M NaCl,10%Glycerol, 1000mM Imidazole. NTA-树脂上海博彩公司有售
20
百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库生物工程实验指导2010(4)在线全文阅读。
相关推荐：