生物工程实验指导2010(5)

实验五 蛋白质免疫印迹分析（Western Blot）

一、实验原理

经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肋作为杭原与对应的抗体超免疫反应，再与酶或同位家标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检查电泳分离的待异性目的基因表达的蛋白成分。

二、试剂与材料

1、SDS-PAGE实验的全部材料 2、电转移装置

3、硝酸纤维察薄膜（0.45μm），滤纸 4、转移电泳缓冲液（pH8.3） Tris 3.03g Glycine 14.4g Methanol 200ml 加蒸馏水溶至 1000ml 5、PBS（pH7.4） Na2HPO412H2O 3.63g KH2PO4 0.24g NaCl 8g KCl 0.2g

加蒸馏水溶至1000ml，15磅（1.034×10Pa）高压灭菌20分钟。 6、洗涤液（PBST） PBS（pH7.4） 1000ml Tween20 0.5ml 7、封闭液：

含5-6%脱脂奶粉之PBS 8、一抗：

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9、酶标二抗：（如辣根过氧化物酶标记的SPA） 10、底物液（临用前配）： 4一氨一1一蔡酚 3mg Mcthanol 1ml PBS（pH7.4） 5ml 30%H2O2 5μl 11、玻璃大平皿 三、操作：

1、对基因工程产物的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。 2、转膜：

（1）切除凝胶多余的边缘部分，用直尺量的胶的长和宽，计算出面积。然后将胶浸入转移缓冲液中平衡10min（摇床上进行）。

（2）载8张同胶大小的滤纸和一张硝酸纤维素膜，均用转移缓冲液平衡10min（摇床上进行）。将两张滤纸叠为一层。

（3）从电极负极到正极依次按下图顺序叠放如下：海绵、滤纸一层、电泳凝胶，硝酸纤维素膜、三层滤纸、海绵，操作时注意不要有气泡出现在里面。固定好后放入电泳槽中，接通电源，以每平方厘米4毫安的恒安电流转移30分钟-45分钟。

3、封闭：

转膜结束，关闭电源，取出硝酸纤维素膜。将膜浸入封闭液中，脱色摇床上缓慢振荡30分钟。

4、加一抗：

将膜用PBST洗三次，每次五分钟，然后加入已作适当稀释的一抗中，37℃振荡1小时，或室温缓慢振荡2小时，或4℃振荡过夜。

5、加酶标二抗：

用PBST洗膜三次，每次五分钟，然后加入酶标二抗，37℃振荡1小时，室温振荡缓慢振荡2小时。

6、显色：

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用PBST洗膜三次，每次五分钟，然后将膜进入到底物液中，轻轻晃动数秒后避光静置，待特异性条带清晰显现即换ddH2O以终止反应。

注意：

1、接触硝酸纤维素膜需带手套。

2、转移电流不能太大以免产热过多，影响条带清晰度。

3、封闭液有小牛血清，脱脂奶粉等。但如果封闭液中含有能和一抗结合的蛋白质、就要避免使用这种封闭液。

4、PVDF（聚偏二氟乙烯）膜是一种新的固相膜载体，有很好的化学稳定性和机械强度，固定效果好，敏感度提高，转移后的标本不仅可做免疫学检测，而且可直接进行蛋白质或多肤的氨基酸序列分析。

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微生物工程学实验

实验一 种子、发酵培养基制备及培养基实消

一、实验目的：

1、 了解种子培养基的配置 2、 了解发酵培养基的配制 3、 掌握培养基灭菌的方法

二、实验器材：

1、 菌种：重组大肠杆菌

2、 种子培养基： 牛肉膏、蛋白陈、NaCl、琼脂糖 3、 发酵培养基：牛肉膏、蛋白陈、NaCl

4、 器材： 无菌吸管，无菌空平皿，吸球，天平，试管，量筒，小烧杯，大烧杯，玻璃棒，

骨匙，pH试纸，分装漏斗，牛皮纸，麻绳，标签

三、操作步骤

配：种子斜面、种子平板、种子培养基20ml(50ml三角瓶)一批、发酵培养基200ml（1000ml三角瓶）一批

1、种子培养基配方：牛肉膏-3.0克、蛋白陈-lO.0克、NaCl -5.0克、蒸溜水-1000毫升、调整pH至7.4—7.6

2、发酵培养基配方：可溶性淀粉-10g、(NH4)SO4-2.6g、KH2PO4-5.7g、K2HPO4-1.7g、蒸溜水-1000毫升、调整pH至7.2—7.4

3、计算称量：根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后分别称(量)取。 4、溶解：一船情况下，几种药品可一起倒入烧杯内、先加入少于所需要的总体积水进行加热溶解(但在配制化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解。个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想)。加热溶解时，要不断搅拌。如有琼脂在内，更应注意。待完全溶解后，

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补足水分到需要的总体积。

5、调节pH：用滴管逐滴加入1N NaOH或lN HCl边搅动；边用精密的pH试纸测其pH值，直到符合要求时为止。pH值也可用pH计来测定。pH值可略高，高压灭菌后pH值会下降。 6、分装：按照实验要求进行分装。装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。

7、加塞：培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基内，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有很大影响。 8、灭菌：在塞上棉塞的容器外面再包一层牛皮纸，以防冷凝水沾湿，便可进行灭菌。培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。常用：121℃、20min

如果分装的斜面，要趁热摆放并使斜面长度适当(为试管长度1/3-l/2，不能超过1/2)。培养基经灭菌后，应保温培养2-3天，检查灭菌效果，无菌生长者方可使用。

四、注意事项

1、配制固体培养基用的琼脂应先行用冷水浸泡，纱布过滤，在调好pH值后加入。 2、配制发酵培养基时应小心溶解淀粉，不要成团。 五、思考题

种子培养基、发酵培养基的应用原理？

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