生物工程实验指导2010(3)

实验二 重组蛋白的诱导表达

一、实验原理

最早建立并得到广泛应用的表达系统是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统，称为Lac表达系统，lac操纵子是研究最为详尽的大肠杆菌基因操纵子，该操纵子的转录受正调节因子CAP和负调节因子lacl的调控。在无诱导物情形下，lacl基因产物形成四聚体阻遇蛋白。与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始，异丙基-α-βD-硫代半乳糖苷（IPTG）等乳糖类似物是lac操纵子的诱导物，它们与阻遇蛋白结合后使之改变构象，导致与操纵基因的结合能力降低而解离出来，lac操纵子的转录因此被激活，由子lac操纵子具有这种可诱导调控基因转录的性质，因此其元件和它们的一些突变体经常被用于表达载体的构建。如前图所示，pET-28原核表达载体中则带有lacl基因，故可用IPTG进行透导表达。

表达载体、目的基因和宿主菌共同构成一个完整的表达系统，因此良好的表达系统不仅与表达载体的目的基因有关，选择合适的宿主菌也十分重要。首先表达载体的启动子应在宿主中具有强起动功效，不同的启动子对应的宿主往往不同，如大场杆菌中的启动子选用大肠杆菌宿主，枯草杆菌启动子选用枯草杆菌宿主，这样有利于充分发挥强启动子的效率；其次，某些表达载体自身不带抑制药基因，用这类载体就应选择能产生抑制物蛋白质的宿主菌，否则表达不能调控，不利于高诳表达目的的基因，第三，表达的蛋白质产物因宿主菌内的蛋白酶作用会发生降解，所以许多用作表达的宿主都经过改造，以便于表达蛋白的积累。当表达的蛋白质对宿主菌有毒害，应考虑换一种宿主细胞，目前，我们对原核生物的了解要比对真核生物更全面更深入。当前开发出的基因工程产品中80%-90%是用的原核生物表达系统。原核生物表达系统因基相关的基本理论和技术方法成熟、操作成本较低而得到广泛的应用。但是表达真核基因方面，因宿主缺少真核生物的蛋白质加工系统（如剪切和糖基化）、基因的密码子偏爱性不同及包含体复性等而受到限制。原核生物除大肠杆菌表达系统外，还有棒状杆菌、枯草杆菌和沙门氏杆菌等表达系统，它们都有各自的优缺点。

二、试剂与材料

1、表达菌株BL21 DE3 plysS感受态细胞 2、pET 28/HBs阳性克隆质粒

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3、LB液体培养基（无抗性） 4、LB液体培养基（kan+） 5、LB平板（kan+）

6、IPTG贮备液：2g IPTG溶于10ml ddH2O，0.22μm 滤膜过滤除菌，分装成1ml/份，-20℃保存。工作 浓度为1mM。

7、器材：

细菌摇床、无菌试管、吸管、三角涂棒、50ml离心管、0.5ml和1.5ml微量离心管管、微量加样器、高速台式离心机、普通离心机、制冰机、-40℃冰箱（菌种保存）等。

三、操作 1、转化

取前面构建的阳性质粒10ng加入 100ul表达细菌（BL21 DE3 plysS）感受态中，冰上放置45分钟，在此过程中可以每隔几分钟用手轻弹Eppendof管，然后进行热休克（42℃水浴90秒，取出立即插入冰中放置5分钟），加入预热的无抗生素的LB液900ul、于37℃摇床中200rpm摇1小时，吸取50-100ul菌液进行均匀涂板，LB平板必须含有相应的抗生素，将LB平板放在37℃温箱中过夜培养。

2、诱导表达

随机挑取数个菌落，各加3ml含的LB液于37℃摇过夜，取出300ul菌液加3ml有抗生素的LB液，作1：10稀释，37℃250rpm摇2小时（OD值约为0.2-0.6），于各管中加100mM IPTG30ul（终浓度为1mM），37℃250rpm摇6小时，进行诱导。诱导后6000rpm离心2分钟，收集菌体，用50ul ddH2O重悬菌体，加等体积2×蛋白上样液（约60ul），于沸水浴中变性5分钟，同时取一个阴性对照（即未加IPTG诱导的菌体）经过变性处理后同时进行SDS-PAGE分析，着有无目的的蛋白表达（下一次实验的内容）。若须纯化蛋白，最好选择一表达量最大的菌种进行以后实验。

3、诱导表达条件的优化

对于不同的可溶性蛋白，进行诱导的IPTG浓度、温度、时间均不同，必须进行选择优化，即在上述不同的条件下分别进行诱导，通过SDS-PAGE分析选择最佳条件进行蛋白诱导、表达和纯化。

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注意：表达菌株的过夜培养物接种，是为了在诱导地培养基中的细菌能尽量处于同步生长状态，以便于产物的大量表达，在按排实验时前一天应考虑到将过夜菌接种培养，该实验的时间较长，第一次操作时，时间安排不当，当天可能做不完，而表达产物又不适合于过夜放置，应当予以注意。

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实验三 重组蛋白的聚丙烯凝胶电泳（PAGE）

一、实验原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳由丙烯酰胺单体和交联剂甲又双丙烯酰胺，在催化剂作用下，形成三维网状结构，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有很高的分辨率，这主要是由于浓缩胶的浓缩效应和分离胶的分子筛效应。

在浓缩胶中，缓冲液pH为6.8,HCI几乎全部解离；甘氨酸的等电点为Ph6,解离度小；蛋白质的等电点多为pH5左右，其解离度在HCI和甘氨酸之间，在电场中，迁移率大小次序为CI＞Pro＞Gly，电泳开始后，CI超过了蛋白质，将蛋白质离子推倒它的后面，Gly则将蛋白质离子推到它的前面，由于浓缩胶和分离胶的不连续pH梯度作用，可在二者之间形成三种离子的界面，蛋白质离子就聚集在Cl和Gly之间，原来lcm厚的样品层可以被压缩至0.25μm，样品被压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。

在分离胶中，缓冲液的pH为8.8,甘氨酸进入分离胶后解离度大为增加，其迁移率与Cl相仿，泳至蛋白质离子前面，因此浓缩效应消失。蛋白质具有不同的电荷和分子量，在经过阴离子去污剂SDS处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，蛋白质分子带上均一负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量，此时，由于凝胶浓度增加，孔径变小，分子筛效应起主要作用，使得电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量大小。

采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果。 二、试剂与材料

1、30%（W/V）凝胶贮存液

丙烯酰胺 30克；甲又双丙烯酰胺 0.8克

加蒸馏水溶到100ml，用新华3号滤纸过滤，棕色瓶中4℃保存 2、4×分离胶缓冲液（HCI调pH至8.8） Tris 18.2g;

SDS 0.4g,加蒸馏水深至100ml 3、4×浓缩胶缓冲液（HCI调pH至6.8） Tris 6.06g;

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SDS 0.4g,加蒸馏水溶至100ml 4、10×PAGE电泳缓冲液 Tris 30.3g; Glycine 144.2g;

SDS 10g,加蒸馏水溶至1000ml 5、2×蛋白上样缓冲液（HCI调pH至6.8） Tris 1.21g; SDS 4g;

2-Mercaptoethanol 10ml; Glycerol 20ml;

Bromophenol Blue 0.2g,加蒸馏水溶至100ml 6、染色液： 95%乙醇 500ml 冰醋酸 100ml

考马斯亮蓝 2.5g,加蒸馏水溶至1000ml 7、脱色液： 95%乙醇 55ml

冰醋酸 75ml，加蒸馏水至1000ml 8、10%过硫酸铵（AP）、TEMED 9、SDS-PAGE低分子量蛋白Maker 97.4、66.2、43、31、20.1、14.4KD 10、SDS-PAGE电泳装置 11、脱色摇床 三、操作

1、将玻璃板洗涤干净，固定于电泳憎上，用0.8%琼脂糖凝胶封底（约高5mm）。2、灌分离胶：

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