生物工程实验指导2010(6)

实验二 发酵种子扩大培养、一级种子制备

一、实验目的：

1、了解种子扩大培养的程序 2、学习一级种子制备的方法

二、实验器材：

重组大肠杆菌、种子斜面、种子平板、种子培养基、发酵培养基、超净工作台、摇床、移液管等

三、操作步骤 1、 种子制备

1.1将冰箱中保存的重组大肠杆菌菌种，无菌操作下接种于种子斜面，37℃中恒温培养16-18h. 革兰染色，镜检。

1.2从种子斜面接种种子平板四区划线分离，37℃中恒温培养16-18h. 2、 种子扩大培养

挑取种子平板上单克隆菌落，接种于20ml种子培养基(50ml三角瓶)，30℃中恒温摇床培养16-18h，即得新鲜种子液。 3、 一级种子制备

1000ml三角瓶中装发酵培养基200ml，用灭菌移液管吸取20ml新鲜种子液接种于三角瓶中，在摇床中30℃、200rpm条件下恒温培养48h。

四、注意事项

1、 将冰箱中保存的菌种取出，应在37℃恒温培养箱中活化3h。 2、 种子培养与一级种子制备的培养基、时间均不同。 3、 摇床的使用应注意转速。

五、思考题

种子扩大培养、一级种子制备的特点与原理？

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实验三 接种与发酵过程控制管理 一、实验目的：

1、 了解大肠杆菌菌发酵的基本过程。 2、 学习发酵过程中的一些重要参数的调控。

二、实验器材：

5L小型发酵罐、空气压缩机、蒸汽发生器、紫外分光光度计等

三、操作步骤 1．上罐前的准备

1.1 洗净发酵罐及各连接管路

1.2 取配制、灭菌好的发酵培养基3L，置于罐内，并加入适量消泡剂 1.3 校正pH电极（pH8.0)和溶氧电极 1.4 按发酵罐的使用方法灭菌（见附录）

2．上罐时的操作步骤

按工艺要求设置培养温度（37℃）、搅拌转速（300rpm）、pH(8.0)、溶氧浓度、罐压及空气流量等参数。当培养温度达到要求的温度时，按照发酵罐接种的方法将培养好的新鲜种子接种入发酵罐中，接种量约10%，接种5 min后立即进行第一次取样。

3．发酵过程中各指标的测定

发酵过程中，虽然能自动监控温度、pH值等重要参数，但是仍然需要专人负责照看，完成下列工作： ? ? ? ? ? 4．放罐

经过大约48h发酵，菌体生长进入稳定期，便可放罐。发酵液离心后得到的上清液进入下一步的分离提纯操作。

5．清洗

经常注意发酵罐的运转是否正常，检查各控制参数是否在合适的范围内，遇到故障及时排除。

每3h取样测定：发酵液的光密度值、镜检观察细胞形态，以了解细胞的生长情况及检查是否有杂菌污染。

随着培养时间的延长，适当调节进气量和搅拌转速，以维持一定的DO值（溶氧浓度）。 定时取样，放入冰箱冷藏保存，至发酵结束后集中测定SOD酶活大小。

每小时记录发酵过程的培养温度、搅拌转速、pH、溶氧浓度、空气流量等参数，并记录操作情况。

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放罐后，向发酵罐内加入2.5L水，搅拌片刻，取出pH、DO电极，清洗干净并要求进行保养放置。

四、注意事项

应严格按照工艺要求规范操作，合理安排轮流值班。

五、思考题

1. 整理发酵过程中所测定的各种数据资料。 2. 写出发酵过程各操作步骤。

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实验四 发酵液SOD活性检测

一、实验目的

1、 掌握酶活测定方法

2、 学习发酵过程中的一些重要参数的调控 二、基本原理

见生化工程SOD粗酶液提取部分。 三、操作

1.将发酵液进行离心，6000rpm，10min，收集沉淀用2.5mM磷酸钾缓冲液洗涤2次，离心收集菌体。

2.用2.5mM磷酸钾缓冲液15mL将菌体重悬，超声破碎细菌至细菌悬液变的清亮透明。8000 rpm，10min，上清即为SOD粗酶液。

3.测定SOD酶活性，具体见生化工程酶活性测定一章。

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生化工程学实验

实验一 超氧化物歧化酶粗酶液的分离纯化

一 目的与要求

(1) 通过超氧化物歧化酶的分离纯化,了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换层析方法的原理。

(2) 掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。 二 原理

超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase) 简称SOD, 它广泛存在于各类生物体内, 按其所含金属离子的不同, 可分为3种: 铜锌超氧化物歧化酶 (Cu·Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD) 和铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。

SOD催化如下反应 :

O2. + O2 +2H → H202+02

在生物体内, 它是一种重要的自由基清除剂, 能治疗人类多种炎症、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老, 对生物体有保护作用。

在重组大肠杆菌里Mn-SOD与菌体蛋白等共存于细菌内, 当细菌破裂后, 用氯仿 –乙醇处理溶血液, 使菌体蛋白沉淀, 而Mn-SOD-SOD 则留在水-乙醇均相溶液中。磷酸氢二钾极易溶于水, 在乙醇中的溶解度甚低, 将磷酸氢二钾加入水-乙醇均相溶液中时,溶液明显分层,上层是具有Cu·Zn-SOD活性的含水-乙醇相,下层是溶解大部分磷酸氢二钾的水相(比重大)。用分液漏斗处理, 收集上层具有SOD活性的含水-乙醇相,再加入有机溶剂丙酮，使SOD沉淀。极性有机溶剂能引起蛋白质脱去水化层, 并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用, 致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时,要求在低温下操作,并且需要尽量缩短处理时间, 避免蛋白质变性。将上一步收集的SOD 丙酮沉淀物溶于蒸馏水中, 在pH7.6的条下,Cu·Zn-SOD带负电, 过DE-52 纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。 三 试剂和器材 1、材料

重组大肠杆菌发酵液。 2、试剂

95% 乙醇, 氯仿,K2HP04·3H20, 丙酮,pH7.6,2.5mmol/L 磷酸钾缓冲液,2OOmmol/L 磷酸钾缓冲液 ,DE-52 纤维素等。 3、器材

离心机,751-GW 型分光光度计, 梯度混合器 , 玻璃柱(1.0 × 10cm), 试管, 自动收集器,紫外检测仪, 移液管, 量筒, 烧杯, 分液漏斗。

四、操作

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