生物工程实验指导2010

生 物 工 程 实 验 指 导

（试用版）

（适用于生物科学和生物技术专业） 主编 高国辉 副主编 李劲松 周晓辉

温州医学院生命科学院

2010年1月

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目录

基因工程学实验

实验一 重组原核表达载体的构建与克隆鉴定???????????? 1 实验二 重组蛋白的诱导表达??????????????????? 9 实验三 重组蛋白的聚丙烯凝胶电泳（PAGE）????????????? 12 实验四 重组蛋白纯化：可溶性His Tag-蛋白的抽提?????????? 16 实验五 蛋白质免疫印迹分析（Western Blot）???????????? 19

微生物工程学实验

实验一 种子、发酵培养基制备及培养基实消????????????? 22 实验二 发酵种子扩大培养、一级种子制备?????????????? 24 实验三 接种与发酵过程控制管理???????????????????25 实验四 发酵液SOD活性检测???????????????????? 27

生化工程学实验

实验一 超氧化物歧化酶粗酶液的分离纯化???????????????28 实验二 超氧化物歧化酶蛋白浓度和酶活性的测定????????????30 实验三 超氧化物歧化酶活性染色鉴定法????????????????33

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实验一 重组原核表达载体的构建与克隆鉴定

一、实验原理

重组表达载体的构建是基因工程实验的第一步，也是目的蛋白进行表达的基础，其关键技术为DNA体外重组，即应用酶学方法，将需表达的基因片段在体外进行特异性切割，与合适的表达载体分子重新连接，组装成一个新的重组表达载体质粒。

表达载体在基因工程中扮演首十分重要的角色，负责克隆目的的基因、指导目的基因在宿主体内的转录和翻译，表达载体内有3个系统完成以上3种功能。

（1）DNA复制及质料DNA的筛选。这一系统与普通的克隆质料一样，由DNA复制起始位点ori和抗药性基因（如氨苄青霉素抗性基因Amp、四环素抗性基因Tet等）来完成，松驰型ori位点能使载体借用宿主的DNA复制体系大量复制载体DNA，同时克隆的目的基因亦得以大量复制，为基因的高水平转录提供足够多的模板，如载体还装配有其它生物的ori，则可在不同生物宿主中进行载体DNA复制，这类载体称为穿梭载体，截体上的抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在有抗生素的培养条件下正常生长，这样就筛除掉不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。

（2）目的基因的转录，这一系统包含启动子、抑制物基因和转录终止子，启动子是一个段能被宿主RNA聚合酶特异性性识别和结合并指导宿主转录目的基因的DNA顺序，位于目的基因的上游，表达载体选用在宿主中起始功能强的强启动子（如原核的Lac,Trp,T7等启动子），目的基因在这类启动子的指导下转录出大量的mRNA，为后一步的蛋白质翻译提供尽

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可能多的模板，抑制物基因产物对启动子起始功能产生抑制，适当的诱导条件可使抑制物失活，启动子功能置新恢复，是一种控制启动子功能的蛋白质，通过它使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，保证转录有效进行，特别是表达产物对宿主害时，控制转录时机尤其置要；转录终止于是一段终止RNA聚合酶转录的DNA顺序，使转录在目的基因之后立刻停止、避免作多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量，启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同的物种宿主中表达的效率也不一样、特别是原核生物和真核生物宿主间期完全不同，相互不能通用，这一点应特别注意。

（3）蛋白质的翻译，这一系统包含核糖体识别位点（如原核的SD顺序）翻译起始密码子和终止密码子。SD顺序与原核宿主核糖休16srRNA特异配对而结合，大肠杆菌SD顺序的成基组成为AGGA，mRNA翻译模板与核糖休的亲和力高低对翻译效率极重要，起始密码子是翻译的起始位点，通常为ATG，编码Met（甲硫氨酸），也有极少数生物利用其他密码子作为翻译过程，这些位点可指导宿主的蛋白质翻译系统准确高效地合成目的基因编码蛋白质，根据位点的构造不同还可分为完整蛋白和融合蛋白表达载体：①完整蛋白表达载体：目的基因直接克隆进其后，利用自身的起始密码子表达编码蛋白，有的载体其启动子后接有SD顺序，另一些载体其启动子后没有接SD顺序，需要目的基因上游带进SD顺序；②融合蛋白表达载体：载体启动子后连有SD顺序和超始密码子并表达另外一种多肽，目的基因按这个多肽的三联密码子阅读框插进多肽基因中的某一位点，表达出来产物为部分多肽与目的蛋白杂合的融合蛋白质。

转录出的mRNA 5’ 上游的SD顺序与ATG的间距长度和组成对目的基因的翻译效率也很关键，间距以6-11个碱基，碱基组成CG比例不超过50%为最好。真核基因在原核生物中表达时，ATG以后的20-40个碱基组成也很重要，通过适当的CG突变成AT的定点突变改造，有时可使表达效率提高几倍甚至十倍以上，视基因不同和改造的位点不同而有不同的提高。

二、试剂与材料

1、菌种：大肠杆菌DH5α菌株（无抗生素抗性）或Topl0F+（四环素抗性） 2、原核表达载体质料：pET28（Ka‘）

3、外源DNA片段：HBVS基因片段（bp）由PCR从病人血清中扩增得到（引物为：LEFT 5 –CGA ATT CAT GGA GAG CAC AAC ATC AGG-3’

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RIGHT 5 –CAA GCT TAA ATG TAT ACC CAA AGA CAA A-3’

上下游分别引入EcoR I和Hind III酶切位点）PCR产物克隆入TA克隆。 4、LB培养基

每升液体LB培养基中含 蛋白胨 10克 酵母浸出液 5克 NaCl 10克 NaOH调pH值至7.0-7.5

每升固体LB培养基：加1.5%的琼脂于液体之中。 高压蒸气灭菌 5、碱解法抽提质粒之深液

溶液I：50mM葡萄糖+25mM Tris-HCI(pH8.0)+10mM EDTA，高压蒸气灭菌 溶液II：0.2N NaOH+1%SDS 溶液III：5M KAC， 60ml 冰乙酸，11.5ml 水， 28.5ml

6、限制性内切酶EcoR I和Hind III及10×酶切缓冲溶，-20℃保存 7、胶回收用低熔点琼脂糖凝或者华舜公司胶回收试剂盒 8、T4连接酶或Takara公司快速连接酶试剂盒 9、感受态细菌制备之溶液 0.1êCl2溶液，4℃保存。 甘油，4℃保存。 10、其他试剂

氨苄青霉素：贮存液100mg/ml，-20℃保存，工作浓度60-100ug/ml 卡那霉素：贮存液50mg/ml，-20℃保存，工作浓度50ug/ml 四环素：贮存液15mg/ml，-20℃避光保存，工作浓度15ug/ml TE缓冲液（pH8.0） 10mM Tris-HCI(pH8.0)+0.1mM EDTA, 4℃保存

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