2015-2016生物药物分离纯化技术实验指导 - 图文(3)

讨论：从上表可以看出各种物质的Rf值不同，计算出的Rf值中，果汁的Rf值与果糖的Rf值最接近，故果汁中最有可能含有果糖。

在点样时，样品点过大，可能会导致样品色谱变宽；果汁色谱颜色深，其原因可能是样品浓度过高;

实验八 透析法脱盐

一、实验目的

学会透析的基本原理和操作。 二、实验原理

蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜，而小分子物质可以自由透过。在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。 三、试剂及仪器 1.仪器

透析管或玻璃纸、烧杯、玻璃棒、电磁搅拌器、试管及试管架。 2.试剂

蛋白质的氯化钠溶液（3个去黄的鸡蛋蛋清与700ml水及300ml饱和氯化钠溶液混合后，用数层干纱布过滤）。1%硝酸银溶液、10%硝酸溶液、10%氢氧化钠溶液、1%硫酸铜溶液。 四、实验步骤

1.用蛋白质溶液做双缩脲反应（加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡摇匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，振荡，观察出现的粉红颜色）。

2.透析袋的预处理。将适当大小和长度的透析袋放在50%乙醇中煮沸1h（或浸泡一段时间），再用10g/L的碳酸钠溶液和1mmol/L的EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水洗涤2-3次，结扎袋的一端。

3.向火棉胶制成的透析管中转入10-15ml蛋白质溶液并放在盛有蒸馏水的烧杯中，或用玻璃纸装入蛋白质溶液后扎成袋形，系于一横放在烧杯的玻璃棒上。

4.约1h后，从烧杯中取出1-2ml水，加10%硝酸溶液数滴使呈酸性，再加入1%硝酸银溶液1-2滴，检查氯离子的存在。

5.从烧杯中另取水1-2ml，做双缩脲反应，检查是否有蛋白质存在。

6.不断更换烧杯中的蒸馏水，并用电磁搅拌器不断搅拌蒸馏水以加速透析过程。数小时后从烧杯的水中不能再检出氯离子时，停止透析并检查透析袋内容物是否有蛋白质和氯离子的存在。（此时应观察到透析袋中球蛋白沉淀的出现，因为球蛋白不溶于纯水）。 五、结果与分析

从氯离子和双缩脲反应检查结果，评价透析的效果。

实验九 等电点法沉析法分离牛乳中酪蛋白

一、实验目的

1、学会牛乳中制备酪蛋白的原理和方法 2、等电点沉析法的基本操作技术 二、实验原理

蛋白质在溶液中有两性电离现象。假设某一溶液中含有一种蛋白质。当pI=pH时该蛋白质极性基团解离的正负离子数相等，净电荷为0，此时的该溶液的是pH值是该蛋白质的pI值。某一蛋白质的pI大小是特定的,与该蛋白质结构有关，而与环境pH无关。在此时，蛋白质之间的静电排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀（isoelectric precipitation）。 三、试剂及仪器 1.材料

鲜牛奶 2.试剂

醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、0.2mol/l PH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液 3、器具

烧杯100ml、玻璃棒、滴管、量筒、离心机、水浴锅、布氏漏斗、表面皿、抽滤瓶 四、实验步骤

1、 将牛奶30ml及醋酸-醋酸钠缓冲液30ml分别水浴加热40摄氏度左右，用8层纱布过滤牛奶。

2、量取加热后牛奶20ml，在搅拌下加入加热后的醋酸-醋酸钠缓冲液20ml，调节PH到4.7.

3、将混合液冷却到室温，3500r/min离心15min，弃去上清液，得酪蛋白粗品。 4、水洗沉淀3次，3500r/min离心10min. 弃去上清液。

5、沉淀中加入乙醇20ml，搅拌片刻。将浑浊液转到布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗涤两次，最后用乙醚洗涤两次，抽干。

6、将沉淀摊开到表面皿上，风干的酪蛋白纯品。 7、计算：

含量=酪蛋白g/100ml牛奶 收率=测得含量/理论含量 理论含量为3.5g/100ml牛乳 五、结果

实验十 柱层析分离色素

一、【实验目的】

1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。 2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。 二、【实验原理】

叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。 分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。 吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。 本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。 三、【实验材料】

原料： 新鲜的菠菜叶

试剂 ： 1． 无水乙醇或95%乙醇 2． 石英砂 3． 丙酮 4． 石油醚（60-90℃） 5.三氧化二铝 6．饱和氯化钠溶液 7.水硫酸钠 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材 ： 层析柱（1×30cm）， 研钵， 蒸馏装置， 脱脂棉， 天平， 烧杯， 过滤漏斗， 玻璃棒， 锥形瓶， 分液漏斗， 试管 ， 铁架台 四、【实验操作】 1． 色素的提取：

20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.

2．样品的浓缩： 将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。 3．层析拄的制备：

15克碱性三氧化二铝加入30毫升石油醚搅拌，浸泡10min.。在层析拄内加入一团棉花在底部，再加入石英砂0.5cm以上，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再填入石英砂0.5厘米高。

4．样品的分离层析：吸附层析分离色素

打开层析拄下部开关，向拄内加入2毫升浓缩液，至液体没入砂内， 再加入石油醚冲洗拄壁，液体浸入砂内，加洗脱液开始层析，可以看到不同色带如图片1，直至第一条色带

洗脱完毕，在拄下面用试管接收第一条色带的洗脱液，如图片2。

五、【实验结果】

六、结果分析：

洗脱过程中，首先有一条黄色的色带圈沿着层析柱下移，色带圈的各个方向的移动速度并不是完全相同，原因在于层析柱的制作过程并不完全均一，使层析柱内部不均匀，以至于色带各方向的移动速度不同。最后收集得到亮黄色的胡萝卜素。 七、【注意事项】

1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。

2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。

3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出。

4、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。

6、洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。因此应控制洗脱流速，以每分钟60~80滴为宜。

7、样品一定要足够浓缩，加样量不要过大，过大，分离条带过宽，如果层析拄不够长，各组分不易分开，易同时洗脱下来；加样量过少，色带不是很清楚，不易观察，效果不好。

8、层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。 八、【实验小结】

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