2015-2016生物药物分离纯化技术实验指导 - 图文(2)

（3）把三只试管放于37℃水浴

（4）每隔5min震荡试管并观察每管中溶液颜色的变化，共反应25min。 （5）观察现象，记录实验结果。 五、 结果与讨论

（1）记录以上实验过程每一步骤的现象，并对现象所说明的问题进行分析。 （2）本实验中加入硫酸铵的目的是什么？

（3）预测试管1、2、3的现象，并说明预测的依据。

实验五：高压匀浆法、珠磨法细胞破碎技术

一、实验目的：细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、超声波等方法。本实验主要介绍高压匀浆法、珠磨法的介绍和使用。 二、实验原理：

1高压匀浆法是大规模破碎细胞的常用方法，作用机理是液体剪切作用，利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。

1.1高压匀浆机工作原理及工作示意图

高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵和排出阀组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 1.2高压匀浆破大肠杆菌

菌体浓度150g×L-1左右(目标蛋白表达量为20%) 用去离子水悬浮，在80MPa压力下，连续高压匀浆三次 。

影响高压匀浆破碎的因素主要有压力、温度和通过匀浆器阀的次数，工业生产中常采用的压力为55－70Mpa。

高压匀浆法操作参数少，且易于确定；且样品损失量少，在间歇处理少量样品方面效果好，在实验室和工业生产中都已得到应用，适用于酵母和大多数细胞的破碎。对于易造成堵塞的团状或丝状真菌以及一些易损伤匀浆阀，质地坚硬的亚细胞器一般不适用。

2、珠磨法：设备是珠后机，，其破碎机理：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。 存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计并且珠子之间的液体损失30％左右。

三、实验操作

两种机器的使用过程及步骤。

实验六 红霉素的萃取与精制

一、实验目的

（1）学会利用溶剂萃取的方法对微生物药物的原理与方法进行提纯； （2）掌握利用提取红霉素的步骤和操作要求。 二、实验原理

萃取过程是利用混合物质各种组分在两个不相混溶的液相中的溶解度的不同，从而达到分离的目的。红霉素在碱性条件下，溶于乙酸乙酯中，在酸性条件下溶于水溶液中给，通过这个原理达到分离提纯的目的。 三、试剂及仪器 1.材料

2g红霉素软膏。 2、器材

量杯、烧杯、布氏漏斗及抽滤瓶、培养皿、分液漏斗、铁架台、剪刀、烘箱等。 2.试剂

乙酸、乙酸乙酯、饱和食盐水、异丙醇、乙醇-醋酸钾溶液（10g醋酸钾溶于100ml无水乙醇中，现用现配） 四、实验步骤

（一）取2g红霉素软膏，放入烧杯中，加6ml乙酸丁酯，用乙酸或乙酸丁酯调pH值为 7.2 ～8.0，抽滤，得澄清滤液，供下一步萃取用。

（二）澄清滤液放入搪瓷缸中用乙酸酸化pH值为3.5～6.0，加乙酸丁酯分两次（每次加10～20ml）进行萃取，每次加入后，要在搪瓷缸内上下翻动，使滤液和乙酸丁酯能充分混合接触，然后静置30 min使之分层，用100ml烧杯收集上层萃取液。

（三）取上述下相液，加入一定体积的饱和食盐水，加入乙酸丁酯分两次萃取，充分混合接触，待静置分层后，将上层萃取液（BA液）倾倒出或吸出，转入另一只烧杯中

（四）结晶和干燥：取量乙醇-醋酸钾溶液，缓慢加入上述BA溶液中，带有沉淀时，搅拌后静置30min后过滤，得红霉素晶体，将湿晶体放入烧杯中，加异丙醇30-50ml，搅拌成浆糊状，然后抽滤，将湿品平铺培养皿中，真空干燥的干品。 五、结果与分析 六思考

pH的调节在提高红霉素萃取效率方面的重要性。 常见的有机溶剂有哪些？

红霉素萃取时为何选用饱和食盐水？（有两个作用一是防止乳化，二是降低有机化合物在水中的溶解度。）

实验七 薄层色谱法鉴定果汁中的糖

一、实验目的

了解薄层色谱法的分离原理，掌握薄层色谱法鉴定果汁中的糖的操作技术。 二、实验原理

对多组分的复杂混合物，无论是有机物或无机物，薄层色谱法是有效的分离手段之一。 硅胶是常用的吸附剂，使用与酸性和中性物质的分离，在一定条件下，硅胶对各种糖分的吸附能力不同。同时，选择适当的展开剂，利用各种糖分的分配系数的差异，从而达到分离。显色后得到色谱图，与在相同条件下已知糖分的色谱图比较就能鉴定果汁中的糖分。

未知物组分的鉴定是通过在同一块薄层板上分别点上标准样品和未知样品，通过比较斑点的比移值来定性鉴定。其中比移值Rf计算公式为：

Rf = 原点至斑点中心的距离/ 原点至展开剂前沿的距离

由于在相同条件下，物质的Rf值是一定的，因而比移值Rf可以进行物质的定性分析。分离之后，可以用适当的方法定量测定，如刮下有色斑点。将被测物浸取后用比色法测定其含量，或用薄层扫描仪扫描直接测出被测物的含量。 三、实验器材

层析缸（筒）（10cm×10cm）；微量注射器，若仅作定性鉴定，则可用玻璃毛细管来替代；薄层板：用10×10cm玻璃板制作硅胶板、可剪截型薄层层析板（10 cm × 10 cm，0.2-0.25 mm铝基硅胶G板，天津市天河医疗有限公司）；吸附剂：硅胶G（(青岛海洋化工有限公司生产，200～260 目，化学纯）

展开剂1：正丁醇：丙酮：水＝4：3：1

显色剂1：苯胺－二苯胺磷酸（临用时配制：2g二苯胺、2ml苯胺、20ml85％磷酸，与200ml丙酮混溶）

显色剂2：：把10ml硫酸缓慢倒入90rnl乙醇中混合冷却，制得10％的硫酸溶液 标准糖溶液：麦芽糖、果汁、蜂蜜、果糖、葡萄糖，分别溶于10％异丙醇中，使其浓度为100mg/ml

新鲜果汁、蜂蜜、无水乙醇 四、实验步骤 （1）制作薄层板

将玻璃板洗净至不挂水，晾干后置于干燥洁净处备用。将10 g硅胶G加适量的水(约25 mL)，在研钵中用研杵向一个方向研磨制成均匀的有适当粘稠度的胶浆，立即倾倒于玻璃板中央，迅速振荡，使硅胶层厚度均匀。涂布好的薄层板于室温下在水平台上晾干，并在105°C温度下活化30 min后，贮于干燥器中备用。硅胶层的厚度约为0.1 mm，使用前用氯仿-甲醇(8:2)预洗，在105°C温度下加热干燥1 h。 （2）点样

在10×10cm的硅胶G薄板上离底边2cm处用铅笔划线，用微量注射器或玻璃毛细管点样（新鲜果汁及标准糖液），各斑点之间相距2cm且每个斑点的直径不超过2mm，每个样品

点4次，每次点样后用冷风吹干或间隔一定时间使其自然干燥。在板上标出起始线和欲展开的前沿线，一般展开距离为7cm以上。 （3）展开

把点样后的薄层板在红外灯烘干（若无红外灯，则在空气中晾干），将配好的展开剂倒入展开缸中，使展开剂在缸中的深度至少有1cm深，盖上盖子，混合均匀。等数分钟后让溶剂在展开缸中饱和后，再将已点好样的晾干的薄层板迅速的放入缸内，尽量不破坏缸内的气氛，盖上盖子。让薄层板的下部浸入展开剂溶液中约0.5cm以上（但注意不要让点样的斑点浸入到展开剂的溶液中，以免被溶液浸洗下来）；

由于吸附剂的毛细管作用，展开剂和斑点不断向上迁移，直到展开剂前沿到事先预定好的刻度线后（一般完成一次展开过程需要25－30分钟），可取出薄层板，。在红外灯下将展开剂蒸发（或在空气中晾干，此过程大约需15分钟）。 （4）显色

在通风橱中，在薄层板上喷雾显色，随即在100°C下烘烤10－20min，注意观察各种糖的颜色和计算Rf，并以此鉴定果汁中的糖分。 五、结果与讨论

1. 计算出果汁中所含糖的Rf；

实验结果如下：从左往右样品分别为：麦芽糖、葡萄糖、果糖、果汁、蜂蜜。 名称 原点至斑点中心的距离cm 原点至展开剂前沿的距离cm Rf 麦芽糖 5.0 7.5 0.667 葡萄糖 5.3 7.7 0.688 果糖 5.1 7.9 0.645 果汁 4.3 7.8 0.551 蜂蜜 5.5 7.9 0.696

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