89:产物*,!-于*<琼脂糖上电泳;分析所扩增片段。
!结果
!+*病毒:01的提取
用紫外分光光
度计进行测定，得出!7,=>和!",=>波长处的测定值之比为*+"?，每次可获得0/@的:01!A6!B;其质和量均能满足反转录模板的要求。
!+!
标准0/@强弱毒株的:2C89:扩增先用通用引物81和8D分别对EF"GH和-3IJ&3进行:2C89:扩增;经
琼脂糖凝胶电泳鉴定;两者的89:产物均为特异性./01条带;其分子量为57!KL。!+F
从病料组织中直接检出0/@的方然后分别用81M8D与81M8/组合对两毒法在病料中加入6A*,倍体积的8DI株进行:2C89:扩增;结果只有81M89研磨;?,,,(Q>$=离心6>$=;取上清;用
配对才能从强毒EF"GH中扩增出靶基常规方法提取病毒:01进行:2C89:因;也只有81M8/组合时才能从弱毒
扩增;结果表明两种病料均为强毒株，见-3NJ&3中得到靶基因;其分子量约为图5。
!6FKL;且为单一条带。相反，81M8/配对或81M89配对均不能从强毒或弱毒中获得靶基因;见图*1和图*D。
!+50/@I9,*分离毒株的:2C89:扩增用引物81和8D分别对分离毒株0/@I9,*O鸡胚毒P进行:2C89:扩
增，结果可得到特异的./01条带。再分
!+6特异性试验分别用不同的引物
组合对本实验室保存的传染性法氏囊病病毒ORD/@P、
鸡传染性支气管炎病毒ORD@P及空白对照鸡胚等进行:2C89:扩增;结果均为阴性，见图F。
5讨论
5+*0/是家禽的一种烈性传染病;但有时却表现出慢性疾病的特点;无典型的临床症状;因而需要一种不仅能够诊
断该病而且能快速区别病原是强毒株还是弱毒株的方法。",年代末到H,年代初;0/@基因组结构的阐明为建立这种鉴别诊断方法提供了可能。早期的研究多集中在:2C89:扩增结合序列分析的方法上;虽然也不失为鉴别诊断
0/@的准确可靠的方法;但测序比较烦琐;成本也较高;难以进行大批量操作。
!2
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曾宪春试
验研究
基于这种情况;我们在反复试验的基础上;初步建立了用:2C89:方法检测
0/@和鉴别0/@强弱毒株的方法;从而
为建立0/的分子鉴别诊断方法奠定了基础。
5+!
89:技术具有快速、灵敏度高、
特异性强的优点;能够克服传统诊断方法操作时间长的缺点;十分利于疫病的快速诊断和疫情监测。本研究用:2C89:
方法诊断0/和鉴别0/@强弱毒株仅需几小时;快捷、
敏感、特异且操作简便;省去了分离病毒、动物接种或基因测序等烦琐的操作过程。
5+5:2C89:方法不仅可对鸡胚毒进
行检测;还可以直接用病鸡组织的匀浆液进行检测。我们除了对标准0/@强弱毒株进行鉴别外;还对从四川某鸡场分离的强毒株进行了:2C89:扩增，从接种该病毒的鸡胚尿囊液中不仅获得了
81和8D的扩增片段;也获得了81和89
的扩增片段;完全符合0/@强毒株的基
因特点。同时从接种该病毒的鸡的肝和
肺组织匀浆液中也得到了与鸡胚毒一样的结果;但用S1分别测定尿囊液和匀浆液时;前者的凝集效价为*T6*!;后者则未能测出;表明:2C89:法的灵敏度远高于S1法。另外;从接种RD/@、RD@和空白对照鸡胚的尿囊液中未扩增出任何特异性片段，证明了该方法的特异性，因此:2C89:是进行0/流行病学调查的极具潜力的方法之一。然而;要建立起一种准确、快速和灵敏的鉴别诊断0/的方法;尚需进一步扩大检测数量。
!
参考文献U
V*W曹殿军;刘培欣;等+鸡新城疫病毒强弱毒株:2C89:
鉴别诊断方法VXW+中国预防兽医学报;!,,,;!!
O7PUF*6CF*?+
V!W阎玉河;邓瑞广;等+用反转录C聚合酶链反应快
速鉴别新城疫病毒VXW+中国兽医科技;!,,,;5,O*PU
（下转第!"页）
$%%&’(()))*+,+-./*01
四川畜牧兽医!""#年第
#
期
试验研究
验被认为是目前用于分离、滴定和血清分型的有效方法，而利用()"*+(的方法不仅可以对核苷酸序列进行分析，且对一些序列较小的突变也能发现，而这些小的突变可以产生一个新的血清型，因此核苷酸序列分析对[NJ的分类定位能更加精确。
同时通过Z6=!、_?W"单酶切得到!$-:<片段（见图!）。把单酶切的质粒与阳性质粒相比较，并用电泳鉴定，得出单酶切后的线性质粒比未经过酶切过的阳，从而证性环状质粒泳动得慢（见图2）实了其特异性的重组。
!$-利用I8?8AG9软件将ZR株核苷酸
序列与标准的毒株进行比较’可以发现
ZR株与B(>"/#-E"E#株的血清型较
近，其同源性为E/‘’用<=6DF?比对也得出同样的结果’因此可初步把ZR株定为
IB))B)BB)B)B)B)II+BIBB))II+
+BBII)+))B))B+)BB)I)BB++IB+))BI+)I))BI))B)BB))B)))B)+BIB+I+BII)))II+)B))))BIB)B+B)+)II)I++B)BIB+B)+))+I))I)B+BBII)IBB)B)II)++)BB+)B))B)BBII))BB)++B)I)IBBIB)I)+BB++BB+BI)))I)BI)))+)II)II)BBB))BI)BII)B))+)+B+))+B+I)BB)IBBB+BII))+)+BI+))+))IBIBB++BI))))B)B))BBBB)+B+)BB)IIBB+)+I)+I))+)BIB+I))+)I))B+)IBBBB)I))B+BBB))I+++))B)I))BI))B)IBB)+I)+IB
-$2序列同源性比较应用I8?8AG9
分析软件将Z/的_J(基因与E个标准毒株进行同源性分析1见表/3’结果表明ZR株与B(>"/#-E"E#株的同源性比较高。
B(>株的变异株。!$!
[NJ的高度变异性决定了该病毒
具有多种血清型’而国内通常用_#-、_/-.疫苗来免疫预防[N并不能提供有力的保护，从基因序列的比较来看，ZR株与
_#-、_/-.的_J(同源性不高’因此很难
对当地鸡群提供有力的免疫保护。所以，选择一些地方分离株制苗可以为鸡群提供有效的免疫保护，使其免受地方毒株的攻击。
!
参考文献4
等$传染性支气管炎病%/&陈德胜’潘杰彦’曹瑞兵，
毒1[NJ3国内分离毒株的分子流行病学分析%,&$病毒学报’-..!’/E1-34/2E"/#!$
%-&于秀俊’郑海州’张莉’等$鸡传染性支气管炎病毒
\2/及疫苗株_#-、_/-.Z/基因的克隆与序列测
定%,&$河北师范大学学报1自然科学版3’-..2’
-L1-34/L/"/L5$
%!&朱毓永’张利平’赵宝华$鸡传染性支气管炎病毒
1[NJ3_#-疫苗株Z/基因的克隆与序列测定%,&$
河北师范大学学报1自然科学版3’-..!’-01234
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