试验研究
!"#$%#&$$%’()*+,-.-(/,0123435(-,56’)(3-)37
!"#$%!法快速鉴别新城疫强弱毒株的试验
俞宁，岳华
（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都S!44(!）
2)P5"SP中图分类号：
8文献标识码：
!44!=)+S(4P=445P=45文章编号：（544P）
地针对#$%强毒扩增出一条长5P(IT的核酸电泳条带；6ER6$引物对能特异性地针对#$%弱毒扩增出一条长5P(IT的核酸电泳条带。
摘要a通过对大量不同毒力#$%’基因核苷酸序列的分析X根据强弱毒株’4裂
解位点的序列差异设计合成了三对引物X建立了快速诊断新城疫并能鉴别其强弱毒株的反转录=聚合酶链式反应&7@=637,方法X整个试验过程可在PG内完成。试验表明X该方法具有快速特异和操作简便的特点X不仅适用于对鸡胚毒的检测X而且适用于对病鸡组织匀浆液的检测X是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。
关键词a新城疫病毒；融合蛋白基因；反转录=聚合酶链式反应
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14-5,6(.’)’51-.)*+789
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!"5方法
标准强毒株!"5"!病毒的纯化
标准弱毒株&-./01.,用散养未&’()*+,、
免疫鸡所产的受精卵自行孵化至+日龄鸡胚复壮，收集尿囊液经差速离心分别离心J4:9?后，(444)444<U:9?，
取上清液，加入54V6*K)444和5V
#.3B，(W沉淀过夜X!4444<U:9?离心J4:9?后弃上清液X即获得浓缩的病毒
样品。
&:)’51;’<E<;d;</;1<.?/D<9T1./;=T0BF:;</;DG.9?<;.190?&7@=637,e.//1.IB9/G;>10>9^^;<;?19.1;d9<]B;?1.?>.d9<]B;?1#$%/1<.9?/"@G<;;/;1/0^/T;D9^9DT<9:;</]/;>9?7@=637e;<;>;/9Z?;>.DD0<>9?Z101G;/;C];?D;/0^#$%e91Gd.<90]/d9<]B;?D;^<0:1G;K;?;I.?f.?>1G;/;C];?D;>9^^;<;?D;/.1’4DB;.d.Z;/91;/I;1e;;?d9<]B;?1.?>.d9<]B;?1/1<.9?/"@G;:;1G0>e./<.T9>X/T;D9^9D.?>/9:TB;^0<:.?9T]B.190?"g1D0]B>?010?BFI;]/;>^0<>9^^;<;?19.B>9.Z?0/9/0^#$%/1<.9?/>;<9d;>^<0:1G;9?0D]B.1;>DG9Df;?;:I<F0XI]1.B/0I;]/;>^0<>9^^;<;?19.190?0^1G;/.:TB;0^19//];G0:0Z;?9A;>B9C]9>"g1e.//]ZZ;/1;>1G.11G;7@=637:;1G0>e./T01;?19.B^0<>9.Z?0/9/0^#$X9?d;/19Z.190?"
>9^^;<;?19.B>9.Z?0/9/0^#$%.?>;T9>;:90B0Z9D.B
!"5"5组织、细胞的处理把采集到的
病料X剪碎研磨X加入灭菌生理盐水配成
!Y!4的悬液X冻融J次后)444Z离心X
取上清X=54W保存。
!"5"J供试毒株7#E的提取将浓缩
加入!:-的病毒沉淀转移至5:-*6管中，
@<9A0B裂解液X室温放置P:9?X加入4"5:-氯仿X(W!5444<U:9?离心!P:9?X取
上清X加异丙醇4"P:-X室温放置!P:9?后X(W!5444<U:9?离心!P:9?。弃去旋涡上清液，加入至少!:-[PV乙醇，混匀，(W[P44<U:9?离心P:9?。小心弃去上清液，室温或真空干燥P\!4:9?，然后将7#E溶于!44!-经$*63处理过的双蒸水中，一部分用于反转录X另有少量用于测定核酸的浓度。
（#$%）=(>?*52)<#;eD./1B;>9/;./;d9<]/h^]/90?T<01;9?h7@=637
!材料和方法
!"!材料!"!"!
毒株
任公司；反转录试剂盒&’9</1/1<.?>
D$#E2F?1G;/9/H91,购自@0F0I.公司；
其它试剂均为分析纯。
#$%标准强毒株&’()*+,
购于中国兽药监察所；标准弱毒株分离毒&-./01.,由本院禽病研究所提供；
株&234!,由本院实验室保存。
!"!"5仪器及试剂637仪&德国
凝胶成像系统（美890:;1<.公司生产,；
国890=7.>公司生产）；紫外分光光度计。@<9A0B、（美国%.<9.?公司生产）@.C酶、
!"!"J引物引物设计是在E"HE#@，
K"HL3M、$"N"%E#700O*-EE7等设计的E、8、3、$四条引物的基础上添加酶
切位点和保护碱基而成的，由宝生物工命名为6E、程&大连,有限公司合成，68、63和6$。
上游引物6E：PQ=K@KEE@@3@@KE@KK下游引物68：3EKK33@3@@K3=JQ；PQ=K@EEK3@@KKEKKE@K@@KK3EK3E@@=JQ；63：PQ=K@EEK3@@EK3K@3@@3@3@K@3@33@=JQ；6$：PQ=K@EEK3@@KE3KE333@K@3@333=JQ。6ER68引物对能特异性地针对#$%扩增出一条长JS5IT的核酸电泳条带；6ER63引物对能特异性
!"5"(D$#E第一链的合成取样品
下7#EP!-X加入7#./;9?G9I910<!!-、
然游引物!!-X小心混匀XSPW保温P:9?，
后依次加入反转录酶!!-、>#@65!-、I]^^;<(!-X用$*63双蒸水补至54!-。
>#@6均购自宝生物工程&大连,有限责
544(=!5=5[收稿日期：
544P=45=54修回日期：
作者简介：俞宁（!+)4=），女，四川西昌人，在读硕士，主要从事预防兽医学方面的研究，公开发表论文5篇。(5W作用54:9?X+(W作用P:9?，然后
冰浴P:9?。获得的D$#E可直接用于
也可置于=54W下保存。637扩增反应，
!"5"P特异性片段的637扩增在637管中加入!4_637I]^^;<&:Z5R^<;;,P"4!-，5P:‘‘Z3B5J"4!-，!4:‘>#@6
本版编辑：曾宪春
8449:;;<<<#=>=/76#)-&%
四川畜牧兽医
!""#年第
#期
#$%&’()*+,!-，
上、下游引物各*+,!-，模别用81M89与81M8/组合对其扩增;结果板./01!+,!-，234/01聚合酶,+56!-，只有81和89配对才能获得特异性条灭菌去离子水57+76!-。89:扩增特异性带。同时;对接种0/@I9,*毒株的试验片段;通过实验进行优化。
鸡的肝和肺等组织匀浆液进行:2C89:*+!+7琼脂糖凝胶电泳分析结果取扩增;所得结果与鸡胚毒的一致;见图!。
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