鸡卵类粘蛋白分离提纯、活性测定与相对分子质量测定(2)

配制浓缩胶

表2 配制浓缩胶试剂表 30% 胶母液 pH 6.7 Tris-HCl缓冲液（含TEMED） 蒸馏水定容至 10% AP（混匀后加入）

0.3 mL 0.8 mL 2 mL 30 μL 灌浓缩胶：将浓缩胶液加到分离胶面上。插上样品梳（注意：梳子的平面对准高玻璃板）。浓缩胶大约20min聚合。

浓缩胶凝固后，轻轻垂直向上提起样品梳（同时用手压住玻璃板），形成一个一个上样井。 1.3.7.2加入电极缓冲液

在电泳槽中加入pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液（新旧均可），使之没过电极丝即可；并在矮板之间加入pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液（只能用新的），使之没过矮板。 1.3.7.3制样（样品变性处理） 低分子量Marker；

牛血清白蛋白（BSA）：取0.5mL离心管，加25μL BSA （0.5mg/mL）和25μL样品缓冲液，混匀；

粗品CHOM：取1.5mL离心管，加50μL粗品 和 50μL样品缓冲液，混匀； 纯品CHOM: 取1.5mL离心管，加50μL纯品和50μL样品液，混匀； 4支离心管置海绵托上沸水浴加热3 min。 1.3.7.4点样

将电泳槽的矮板朝向自己，从左到右的上样井分别为1#—10#。按下列顺序和量加样：

表3 点样顺序

泳道 样品 点样量（ug) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 粗品 粗品 粗品 粗品 BSA Marker 纯品 纯品 纯品 纯品 10 10 5 5 10 20 10 10 5 5 1.3.7.5电泳

在电泳槽的正极槽加电泳缓冲液，没过电极丝即可；负极槽加缓冲液，一定要没过矮玻璃板。 插好电泳仪电源，连接电泳仪和电泳槽之间的电极线。样品在浓缩胶里，调节电压：150V。样品在分离胶里，调节电压：220V。当指示剂染料距离凝胶底部约1cm时，停止电泳，记录电泳时间。 （注意：先将电压慢慢调节到0，再关掉电源）。 1.3.7.6剥胶

弃去电泳槽正极缓冲液，回收负极缓冲液。取出玻璃板，小心撬开玻璃，在1#上样井对应的胶底部切下一个小三角做标记。小心将胶剥入大培养皿中。 1.3.7.7染色和脱色

在大培养品皿中加入考马斯亮蓝染色液，以没过凝胶能使凝胶悬浮为宜。摇床上染色10min，将染液回收到原来的试剂瓶。用自来水将凝胶表面的浮色洗去，加入脱色液，摇床脱色至条带清晰。 1.3.7.8纯度鉴定及相对分子质量测定

标明电泳图谱中各个泳道、标准蛋白的相对分子质量及纯品CHOM条带；计算标准蛋白各条带、纯品CHOM的相对迁移率；以相对分子质量的对数为纵坐标，相对迁移率为横坐标，绘制标准曲线，根据公式计算CHOM的相对分子质量的对数，再换算为相对分子质量。 1.3.8纯化结果

根据实验记录，计算粗提和柱层析步骤的总体积、总蛋白、总抑制活力、比活力、收率及纯化倍数，填写纯化总表。

总蛋白=总体积（mL）×蛋白质浓度(mg/mL)； 总活力=总体积(mL)×每毫升的抑制活力(U/mL)； 比活力=总抑制活力(U)÷总蛋白(mg)；

收率=纯品的总抑制活力(U)÷粗品的总抑制活力(U)； 纯化倍数=纯品的比活力(U/mg)÷粗品的比活力(U/mg)。

表4 结果 步骤 丙酮-TCA粗提 2 结果与讨论：

2.1鸡卵类黏蛋白的粗品制备

鸡蛋清的体积为：30ml Vcrude=8.6ml 2.2粗品的处理

总体积/mL 总蛋白/mg 总抑制活力/U 比活力U/mg 收率/% 纯化倍数 DEAE-Cellulose-52纯化 测得柱高为13.5cm，柱体积为10.6cm3，流速v=1ml/min。 2.3鸡卵类黏蛋白的分离纯化

0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液洗脱时，A值变化情况：当A值急剧上升到最高值4时，时间经历2min；下降到数值稳定时，时间经历2min。

改用0.3 mol/L氯化钠-0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液进行洗脱时，A值变化情况：当A值急剧上升到最高值70时，时间经历19min；下降到数值稳定时，时间经历12min； 共收集3.4ml。（未透析）

用0.5 mol/L氯化钠-0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液洗脱时，没有蛋白峰出现。 Vpurified=3.4ml

图1 洗脱顺序

2.4Folin-酚法测定蛋白质浓度

标准曲线测定

表5 曲线测定 标准蛋白质/uL 水/uL 蛋白质含量/ug G-250（mL） A595

1 0 100 0 5

2 20 80 2 5

3 40 60 4 5

4 60 40 6 5

5 80 20 8 5

6 100 0 10 5

0.000 0.167 0.201

图2 标准曲线

0.461 0.792 0.924

样品测定

粗品稀释倍数: 50倍；测定A595=0.0885×M粗=0.143 纯品稀释倍数：5倍；测定A595=0.0885×M纯=0.184 粗品蛋白含量（ug）=1.61；纯品蛋白含量（ug)=2.08

粗品蛋白质浓度（单位：mg/mL）=0.805；纯品的蛋白质浓度（单位：mg/mL）=0.805 粗品总蛋白质含量（mg）=6.923；纯品的总蛋白质含量（mg）=0.3536 2.5BAEE法定量测定鸡卵类黏蛋白的抑制活性

M测=10mg/mL×0.05mL=0.5mg

表6 抑制活性测定

样品 A253值 时间（s） 胰蛋白酶 粗品 纯品 0.0 30.0 60.0 90.0 120.0 150.0 180.0 0.082 0.142 0.168 0.182 0.180 0.179 0.174 0.069 0.131 0.135 0.161 0.163 0.171 0.177 0.082 0.102 0.119 0.149 0.151 0.168 0.179

图3 抑制活性测定

胰蛋白酶活力测定实验：

胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）=?A /?t×0.001=86U

胰蛋白酶比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=（?A /?t×0.001）÷M测=172U /mg

（式中:?A/?t为每min 吸光度值的增加；M测指测定时所加胰蛋白酶的量，单位为mg；M测=50μL×10mg/mL=500μg=0.5mg；0.001为吸光度值增加0.001单位定为1个BAEE活力单位的常数。） 粗品抑制实验：

胰蛋白酶剩余活力单位（BAEE单位）=66U 比活力=酶活力单位/毫克蛋白质 =132U/mg

黏蛋白粗品的总抑制活力： 黏蛋白粗品的抑制活力(U)：=86—66 =20U 纯品抑制试验：

胰蛋白酶剩余活力单位（BAEE单位）=37U

比活力=酶活力单位/毫克蛋白质 =74U/mg

黏蛋白纯品的总抑制活力： 黏蛋白纯品的抑制活力(U)：=86—37 =49U

2.6聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度及测定相对分子质量

电泳图：

图4 经染色后的电泳图

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1、10ug粗品 6、20ugMarker

2、10ug粗品 7、10ug纯品 3、5ug粗品 8、10ug纯品 4、5ug粗品 9、5ug纯品

5、10ugBSA 10、5ug纯品

Marker 兔磷酸化酶

BSA 兔肌动蛋白 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂

溶菌酶

分子量 97000 66200 43000 31000 20100 14400

溴酚蓝前沿（cm） 迁移距离(cm) 分子量对数 4.99 4.82 4.63 4.49 4.30 4.16

迁移率

5.65 5.65 5.65 5.65 5.65 5.65

1.3 1.9 2.7 4.0 5.1 5.5

0.230 0.336 0.478 0.708 0.903 0.973

表7 相对分子质量计算

图5 相对分子质量计算

2.7纯化结果

表8 结果

步骤 丙酮-TCA粗提 DEAE-Cellulose-52纯化 总体积/mL 8.6 3.4 总蛋白/mg 6.923 0.354 总抑制活力/U 86000 8330 比活力U/mg 132 74 收率/% — 83 纯化倍数 — 0.56 2.8讨论

2.8.1取鸡蛋清时应注意不要取出蛋黄。

2.8.2每一步要详细记录实验数据以及各步骤必要的时间，对于较多的试剂应事先做好分类，明确每一步应该加入的试剂及试剂量，防止加错试剂对实验造成的影响。

2.8.3做蛋白质纯化实验时，由于步骤较多应做好人员的分配和分工，洗脱平衡过程中，要观察数值的变化记录始末过程，观察峰值以便进行洗脱液的收集，此步骤是实验的关键。能否成功将影响后边SDS-PAGE测定CHOM的分子量。

2.8.4用BAEE法测定CHOM的活性，应注意样品的预热以及预热的时间。使用分光光度计应注意分光光度计的调零，以及调零后应重新计时5min。

2.8.5SDS-PAGE电泳时，剥胶时应该注意胶的脱落，防止破碎。

2.8.6由于本实验需要经过蛋白质的粗提，蛋白质的纯化，BAEE法测活性以及SDS-PAGE测定分子量等，综合性较强且时间较长，操作方法复杂，以及使用仪器较多，要做好每次实验前的预习，操作应该谨慎小心。同时本实验需要各组员的相互配合，只有团队的相互合作才能更好的完成实验。

参考文献

[1]蔡祖花;王凤山;张天民; 胰蛋白酶抑制剂的临床研究概况[J]. 中国生化药物杂志.2000,03（10）：35-37. [2]柳武革; 薛庆中; 蛋白酶抑制剂及其在抗虫基因工程中的应用[J]. 生物技术通报.2000,01(3):227-229.

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