鸡卵类粘蛋白分离提纯、活性测定与相对分子质量测定

鸡卵类黏蛋白的分离纯化及性质测定

巩海雪，崔晓东，张岩，王晶晶

（河北大学生命科学学院，河北保定071002）

摘 要： 通过本次实验的学习，主要目的是掌握蛋白质的提取、分离、纯化及性质测定方法，了解其应用。掌握离子交换柱层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与技术以及离心机、分光光度计、核酸蛋白检测仪、电泳仪等实验仪器的使用。

鸡卵类黏蛋白是从鸡卵清中分离的糖蛋白，在pH7.8~8.0的碱性条件下，具有很强的结合胰蛋白酶的活性，而且这种结合是可逆的，因此，可以制成亲和吸附剂，用以纯化胰蛋白酶，其抑制胰蛋白酶的摩尔比为1：1，1μg高纯度的卵类黏蛋白能抑制相当于0.86 μg的胰蛋白酶（比活力为12000BAEE U/mg）。本实验主要参照Kassell所述的方法，先将鸡蛋清经三氯乙酸-丙酮溶液和离心处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，再经过DEAE纤维素柱层析纯化而得合格产品。运用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度；用BAEE法对鸡卵类粘蛋白活性进行测定，通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测类粘蛋白的纯度及相对分子质量。

通过本实验的学习得出类粘蛋白是一种专一性很强的胰蛋白酶抑制剂，胰蛋白酶能水解酯键,酰胺键和肽键,利用这一性质用人工合成的底物或天然的蛋白质可以测定胰蛋白酶的活力,由此可计算类粘蛋白的活力。

关键词： 鸡卵类粘蛋白 纯化 胰蛋白酶 相对分子质量 抑制 活性

The purification and properties determination of CHOM

GONG Haixue, CUI Xiaodong, ZHANG Yan, WANG Jingjing

Abstract:Through the experimental，the main purpose is to master the technology of protein extraction,

isolation, purification and properties mensuration and understand the use.Master the principle and technique of ion exchange column chromatography and polyacrylamide gel electrophoresis and the usage of centrifuge, spectrophotometer, nucleic acidprotein detector, electrophoresis apparatus and so on.

CHOM is a glycoprotein separated from egg white. In alkaline condition of pH7.8~8.0,it has a strong combination with trypsin and it is reversible. Thus it can be used to made the affinity adsorbent which is used for trypsin purification. Molar rattio of trypsin inhibion is 1:1. 1ug high purity ovomucoid can inhibits 0.86ug trypsin( specific activity: 12000BAEE U/mg).This experiment mainly refers to the method of Kassell said. First, remove the miscellaneous protein in egg white by TCA – acetone and centrifugal. Then, get the crude protein by acetone fractional precipitation. Then, get the qualified protein by the purification of DEAE cellulose column chromatography. Using coomassie brilliant blue method determines the concentration of protein; Using BAEE method determines the activity of CHOM. Through SDS-page polyacrylamide gel electrophoresis to determine the purity and relative molecular mass of CHOM.

Through the experiment, we conclud that chicken ovomucoid is a kind of specificity strong trypsin inhibitors, can hydrolyze ester keys, amides keys and peptide bond. Using this nature and synthetic substrate or natural protein can determine the vitality of trypsin and we can calculat the vitality of chicken ovomucoid.

Key words: CHOM purification trypsin relative molecular mass inhibion activity

鸡卵类粘蛋白（chicken ovomucoid 简称CHOM）是鸡卵清中含有的一种糖蛋白，在电泳行为上常出现不均一性，这主要与糖蛋白的分子量不均一性有关。鸡卵类粘蛋白

具有强烈抑制胰蛋白酶的作用，是胰蛋白酶的天然抑制剂，胰蛋白酶抑制剂是一类具有胰蛋白酶抑制作用的物质，该类物质的来源不同 ,其活性和作用的酶也不同，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究[1]。另外对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。另外,蛋白酶抑制剂可以抑制昆虫的生长和发育，近年来在抗虫基因工程得到了广泛的应用[2]。CHOM在中性和偏酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度，但在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度较高时易迅速失活。由于CHOM在PH7.8～8.0的碱性条件下具有很强的结合胰蛋白酶的活性而且这种结合是可逆的，可以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离和纯化胰蛋白酶。

1材料与方法

1.1材料

新鲜鸡蛋、三氯乙酸溶液、丙酮溶液、DEAE-纤维素、 0.2 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液、0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液、0.3mol氯化钠-0.02mol PH6.5磷酸盐缓冲液、0.5 mol/L氯化钠-0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液、3.0 mL BAEE- 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液、0. 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液、0.0 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液胰蛋白酶、30% 胶母液、pH 8.9 Tris-HCl缓冲液（含TEMED）、10% AP、pH 6.7 Tris-HCl缓冲液（含TEMED）、pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液、BSA、Marker、考马斯亮蓝染色液、脱色液 1.2仪器

离心机、恒温水浴锅、冰箱、电磁锅、紫外分光光度计、电泳仪、摇床、核酸蛋白检测仪、透析袋、铁架

台、层析柱、微量取液器。

1.3 方法

1.3.1鸡卵类黏蛋白的粗品制备

两人一组，取1枚新鲜鸡蛋蛋清，量出准确体积并记录（约30mL），盛于250mL烧杯内，烧杯置于25～30℃恒温水浴锅内，边搅拌边缓慢加入等体积4℃预冷的三氯乙酸（TCA）－丙酮溶液（1:4体积比），出现大量白色沉淀，为杂蛋白，此时溶液的pH约为6～7，保温30min。

用大约7～8 mL 0.5mol/L TCA调节至pH3.5，使杂蛋白沉淀完全，在4℃下放置1h, 4000 r/min离心20 min，轻轻将黄绿色上清液倒出，每2个人量取20mL，4个人合并为1组，共40mL，倒入250mL三角瓶中，用纸封口、贴标签放入冰箱中冷藏。

4倍于上清液体积的-20℃预冷的丙酮 （ 160mL ）， 边搅拌边加入黄绿色上清液中，可见白色沉淀产生，在4℃冰箱中放置1－2 h。

从冰箱中取出三角瓶，将上清液缓慢倒出，尽量少剩余上清液，总体积最多不超过40mL。配平，4000 r/min离心20 min，弃上清液，得CHOM沉淀，加入4mL无离子水溶解。

将透析袋用无离子水煮沸10min，无离子水清洗干净，一端用橡皮筋绑紧，试漏，再将4mL 装入透析袋，赶出透析袋中的气泡，留出约1cm高度，绑紧另一端，对无离子水透析，更换数次无离子水，以除去残留的TCA和丙酮，透析过程中有少量沉淀出现。

取出透析袋中的黏蛋白溶液，4000 r/min离心20 min，弃沉淀，用10 mL量筒测量体积，记录体积并记为Vcrude。 1.3.2粗品的处理

取将粗品分装到4个离心管中：

1号：分0.9mL，加入0.10mL 0.2 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，摇匀，使其盐终浓度为0.02 mol/L。 2号：分0.9mL，加入0.10mL 0.2 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，摇匀，使其盐终浓度为0.02 mol/L。 3号：0.9mL（用于活性测定）

4号：剩余的都装入7ml的4号离心管中（用于蛋白质浓度测定和电泳）。 1.3.3鸡卵类黏蛋白的分离纯化 1.3.3.1装柱

层析柱垂直安装在铁架台上，用水止夹紧柱下端的硅胶管。先加入1/3～1/2柱体积的水，在柱的上端插一合适大小的玻璃漏斗，使漏斗颈的外径与层析柱的内径吻合，以防层析柱中的水或缓冲液渗出。

将处理好的DEAE-纤维素调成浆糊状，倒入漏斗，不断搅拌，使之自然沉降到1cm左右的高度。 打开柱下端的水止，继续搅拌漏斗内的纤维素，使之沉降至3/4柱高。

将柱下端的硅胶管连接在核酸蛋白检测仪样品池的入口，打开核酸蛋白检测仪电源，将波长置于280nm处，预热至少30min，准备一个烧杯，收集样品池出口的流出液。 1.3.3.2平衡

柱体积的计算：测量柱床的高度，柱内径为1cm，底面积乘以高等于柱床体积。

用3倍柱体积的0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液（起始液）平衡层析柱，平衡过程中，调节流速，使之在1～1.5m L/min之间。始终保持柱床上边最少有2cm高度的缓冲液，注意不能干柱。

平衡过程中，调试核酸蛋白检测仪。首先将旋钮拨到T100%(指透光率)，调“光量”到显示100。 再将旋钮拨到 A（吸光度）（A有不同灵敏度，一般选择0.5A），调节“调零”到显示0。继续平衡，如数字有波动，反复调节几次，使A值保持为0。 1.3.3.3上样

待平衡缓冲液即将全部流入柱床时，立即贴壁加1号试管的粗提样品，使样品全部缓慢流入层析柱床内，立即加起始液到柱床上边保持2cm高度。 1.3.3.4洗脱

首先以3倍柱体积的起始液（0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液）洗脱，保持流速不变，观察核酸蛋白检测仪的A值变化情况。当A值急剧上升时，开始计时，同时换干净试管收集对应的流出液（核酸蛋白检测仪的样品池出口），每收集2mL，换一支试管，当A值上升到最高值时，计时，下降到数值稳定时，计时。

当数字下降到稳定不变时，停止收集流出液，准备更换另一种洗脱液。

改用0.3 mol/L氯化钠-0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，同样，当A值急剧上升时收集，计时，准备数只试管，编号，收集对应的流出液，每收集2mL，换一支试管，当A值上升到最高值时，计时，下降到数值稳定时，计时。

当数字下降到稳定不变时，可停止收集流出液。准备更换另一种洗脱液（这部分流出液即为离子交换纯化的卵类黏蛋白）。

继续用0.5 mol/L氯化钠-0.02 mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液洗脱，观察是否有蛋白峰出现，如有蛋白峰，继续收集（一般情况下不再有蛋白峰出现），洗脱1个柱体积的溶液即可。

用1倍柱体积起始液继续平衡柱子，用吸耳球将柱子内的纤维素吹到回收瓶回收，清洗核酸蛋白检测仪的样品池，以10mL无离子水清洗核酸蛋白检测仪样品池，从进样口注射无离子水，至出样口流出。

先合并第二次洗脱时对应A值较高的收集液试管，如果透析袋装满，A值较低的收集液 弃去不用。如果透析袋未装满，则合并 A值较低的收集液 。装满一根透析袋，上面加蔗糖晶体，利用蔗糖吸水性质，将透析袋里边的水吸出，最后，透析袋内的溶液浓缩到2~3mL之间。将干瘪的透析袋一端的橡皮筋解开，将浓缩的纯品溶液（较粘）集中在一端，重新绑好皮筋。透析袋再对无离子水透析， 测定纯化后鸡卵类黏蛋白的总体积，记为Vpurified， 最大体积不要超过5mL。 1.3.4纯品的分装

1号管：从纯品中取0.9mL，用于BAEE法测定抑制活性。

2号管：剩余的纯品，用于测定蛋白质浓度、电泳测定相对分子质量。 1.3.5Folin-酚法测定蛋白质浓度 1.3.5.1标准曲线测定

标准曲线测定加样表 试剂 1 BSA（uL） 水（ uL ） 蛋白质含量（ug） G-250（mL） A595 1.3.5.2样品测定

粗品：取50uL，加水200uL，即稀释5倍。取其中20uL，加水180uL（稀释倍数）。取100uL 样品，加5mL染液，室温反应2min，以标准曲线中1号管为对照调零，测定A595。

纯品：取50uL，加水 200uL （稀释倍数）。取100uL 样品，加5mL染液，室温反应2min，以标准曲线中1号管为对照调零，测定A595。

计算CHOM粗品、纯品的蛋白质浓度（单位：mg/mL）；查阅记录的Vcrude 和Vpurified，计算粗品和纯品的总蛋白质含量（mg）。

1.3.6 BAEE法定量测定鸡卵类黏蛋白的抑制活性 1.3.6.1计算胰蛋白酶活性和比活力

取一只石英比色皿（带盖，光程为1cm），加入25℃预热的3.0 mL BAEE- 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，在紫外分光光度计的动力学模式下，测定A253，以此为空白，校正100%T/0Abs 。

取出比色皿，加入50 μL胰蛋白酶液（酶浓度10mg/mL)，立即混匀，测定A253的增加，每隔30秒读一次数，测定185秒。（一般情况下，此浓度酶液催化底物显色，A值呈线性增加，若?A/min＞0.400，则酶液需要稀释或减量）。

计算胰蛋白酶活性和比活力：根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔(?t)与相应吸光度值变化（?A），按以下公式计算胰蛋白酶的活力单位和比活力。

胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）=?A /?t×0.001；

比活力=酶活力单位/毫克蛋白质=（?A /?t×0.001）÷M测； （式中:?A/?t为每min 吸光度值的增加） M测指测定时所加胰蛋白酶的量，单位为mg；

0 0 5 2 20 2 5 管号 3 40 60 4 5 4 60 40 6 5 5 80 20 8 5 6 100 0 10 5 100 80 标准蛋白质浓度：100ug/mL，即0.1ug/uL

（M测=50μL×10mg/mL=500μg=0.5mg）

0.001为吸光度值增加0.001单位定为1个BAEE活力单位的常数; 1.3.6.2卵类黏蛋白抑制活性测定

取出4号管内的粗品，取0.9 mL，临用前加0.10mL的0. 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，混匀，从中取10μL，加90μL 0.0 5 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，混匀（即稀释10倍）。取20μL 稀释的Vcrude与100μL胰蛋白酶溶液混合，在25℃保温10min左右，使酶与抑制剂充分结合。

取一只石英比色皿，加入25℃预热的3 mL BAEE- 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，动力学模式下测定A253，以此空白校准。将黏蛋白粗品抑制后的60 uL混合液，加入比色皿中，迅速混匀，动力学模式下测定A253变化， 每隔30秒读一次数，测定185秒，记录每30秒的测定数据。

计算粗品抑制活力：根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔(?t)与相应吸光度值变化（?OD），按前述公式计算粗品抑制后的胰蛋白酶剩余活力；胰蛋白酶活力(U)－粗品抑制后的剩余活力(U)=黏蛋白粗品的抑制活力(U)；依据粗品总体积，计算出黏蛋白粗品的总抑制活力。

取出1号管保存的0.9mLVpurified ，加入0.10mL 0.5 mol/L pH 8.0 Tris-HCI缓冲液，供测定纯品对胰蛋白酶的抑制活性。取20μL Vpurified（不稀释！）与100μL胰蛋白酶溶液混合，在25℃保温10min左右，使酶与抑制剂充分结合。

在一只石英比色皿中，加入25℃预热的3mL BAEE- 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，动力学模式下测定A253 ，以此调零。将黏蛋白纯品抑制后的60uL混合液，加入比色皿中，混匀，动力学模式下测定A253变化，每隔30秒测定一次，记录数据，测定3～5min。

计算纯品的抑制活力：根据时间－光密度关系曲线中的直线部分，任选一时间间隔(?t)与相应光密度值变化（?OD），按前述公式计算抑制后的胰蛋白酶剩余活力；胰蛋白酶活力(U)－纯品抑制后的剩余活力(U)=黏蛋白纯品的抑制活力(U)；依据纯品体积（取1mL粗品经柱层析纯化、浓缩），折算得到黏蛋白纯品的总体积，计算黏蛋白纯品的总抑制活力。 1.3.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度及测定相对分子质量

洗净的玻璃板以矮板向内，高板向外装入垂直板电泳架，并固定好。在两玻璃板之间加满蒸馏水，检查是否漏液。倒掉蒸馏水，用吸水纸吸去残留水。 1.3.7.1制胶和灌胶

配制分离胶

表1 配制分离胶试剂表 12% 分离胶 30% 胶母液 蒸馏水定容至 10% AP（混匀后加入）

灌分离胶：在加入过硫酸铵混匀之后，应在5min内灌胶。将配制的分离胶液加在玻璃板之间，加到高出灰色横梁2mm。用取100微升水，轻轻加在胶面上。（目的：隔绝空气，消除氧气对凝胶聚合的抑制作用。）

一定要待分离胶聚合以后（大约20-30min），可见水与凝固的胶面之间有折射率不同的界线，倒去上层水，再用滤纸条吸去胶面上多余的水，注意不要碰到胶面。

2.8 mL 7 mL 60 μL pH 8.9 Tris-HCl缓冲液（含TEMED） 1.8 mL

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