营养饲料分析实验指导(2)

2）标定

① 无水碳酸钠标定

精密称取在300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠0.1g，准确至0.0001g，加蒸馏水50ml使溶解，加甲基红—溴甲酚绿混合指示剂10滴，用盐酸标准溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗紫色为终点。同时做空白试验。根据下式计算HCl标准溶液浓度：

W无水碳酸钠分子量/2HCl（mol/L）?（V?V0）/1000W?2000?（V?V0）?106.0

式中，W—基准无水碳酸钠的称取量（g）；

V—滴定时消耗盐酸标准溶液的体积（ml）；

V0—空白试验滴定时消耗盐酸标准溶液的体积（ml）。

② 硼砂标定

称取0.1g干燥的四硼酸钠（即硼砂Na2B4O7·10H2O，GB 632-78，分析纯），准确至0.0001g，置于250ml锥形瓶中，加100ml蒸馏水溶解，加甲基红指示剂5～6滴，用0.05mol/L

盐酸标准溶液滴定至溶液由黄变橙色为止。根据下式计算HCl标准溶液浓度：

HCl（mol/L）?W硼砂分子量/2V/1000?W?2000V?381.4

式中，W—四硼酸钠称取量（g）；

V—滴定消耗HCl溶液体积（ml）。

每次标定至少取3份平行样进行操作，计算结果的相对偏差不得超过0.2%，否则需重

新标定，以其算术平均值作为标定结果。

8. 蔗糖（HG 3-1001-76），分析纯。 9. 硫酸铵（GB 1396-78），分析纯。 五、试样的选取与制备

取具有代表性试样，粉碎至40目，用四分法缩减至200g，装于密封容器中，防止试样成分的变化或变质。

六、测定步骤 1. 消化

称取0.2g左右试样（含氮量5～80mg）准确至0.0001g，无损失地移入消化管中，加入硫酸铜0.2g，硫酸钠3g，与试样混合均匀，再加浓硫酸10ml，置于消煮炉上小心加热，待样品焦化，泡沫消失，再加强火力（410℃），至溶液澄清则消化完毕。

将试样消化液冷却，无损失地转移至100ml容量瓶中，冷却后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，则为试样分解液。

2. 蒸馏

取2%硼酸溶液20ml至锥形瓶中作为反应吸收液，并加混合指示剂2滴，将半微量蒸馏装置的冷凝管末端浸入该液面下。

准确移取试样分解液10ml注入蒸馏装置的反应腔中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞

好玻璃塞，并在入口处加水密封好。再在碱液入口缓慢加入10～20ml 40%氢氧化钠溶液，亦使之流入反应腔中，并把碱液入口封存好。

进行蒸馏。以锥形瓶中溶液变蓝绿色开始计时3min，然后将冷凝管末端离开锥形瓶液面，再蒸馏1min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液亦流入吸收液中。

3. 滴定

用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L的HCl标准溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。

4. 空白测定

称取蔗糖0.01g，以代替试样，按上述测定步骤进行空白测定，消耗0.05mol/L盐酸标准溶液的体积应不得超过0.3ml。

七、结果计算 1. 计算公式

粗蛋白质（%）?N%?6.25??V1?V0??C?0.0140W?V'V?6.25?100??V1?V0??C?87.5W

式中：V1—试样滴定所需盐酸标准溶液的体积（ml）；

V0—空白滴定所需盐酸标准溶液的体积（ml）； C—盐酸标准溶液的浓度（mol/L）； W—试样重（g）；

V—试样分解液总体积（ml）； V'—试样分解液蒸馏用体积（ml）；

0.0140—每ml盐酸标准溶液相当于氮的g数； 6.25—氮换算成蛋白质的平均系数。

2. 重复性

每个试样至少取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。

当粗蛋白质含量在25%以上时，允许相对偏差≤1%；当粗蛋白质含量在10%～25%时，允许相对偏差≤2%；当粗蛋白质含量在10%以下时，允许相对偏差≤3%。

3. 测定步骤的检验

称取0.2g硫酸铵，准确至0.0001g，代替试样，按测定步骤进行操作，并按上述公式计算（不乘系数6.25），测得硫酸铵含氮量为（21.19±0.20）%为合格。否则应检查加碱量、蒸馏和滴定等步骤是否正确。

八、注意事项

1. 本方法不能区别蛋白氮和非蛋白氮。在测定结果中除蛋白质外，还有氨基酸、酰胺、铵盐等，故以粗蛋白质表示。

2. 消化过程中，硫酸铜为催化剂，硫酸钠起提高沸点的作用。

3. 蒸馏时，蒸馏装置的蒸汽发生器内的水应加甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，且保持此溶液为橙红色，以防止水中氨态氮的逸失影响测值。

4. 每次蒸馏结束后，应用蒸汽将蒸馏装置反应腔中残液洗净。

5. 试样中硝酸盐和亚硝酸盐含量将直接影响测定结果的准确性。据化学理论与实际测定证实有如下反应：

2NO?3?????2NO?2△还原剂?2?O2

NH?4?NO???N2??2H2O?

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故本法在消化过程中，试样中的硝酸根(NO3)可还原为亚硝酸根(NO2)，而NO2则可与铵离子(NH4)生成氮气(N2)逸出，从而使测值偏低。

九、其他

除本节介绍饲料粗蛋白质测定方法外，有条件者可通过定氮仪进行粗蛋白质的快速测定。

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实验五 饲料中粗纤维的测定（酸碱处理法）

一、原理

用固定浓度的酸和碱，在特定条件下消煮样品以除去粗蛋白质、粗脂肪和无氮浸出物，

再经高温灼烧扣除矿物质的量，所余量为粗纤维。它不是一个确切的化学实体，只是在公认强制规定条件下测出的概略养分。其中以纤维素为主，还有少量半纤维素和木质素。

二、适用范围

本方法适用于配合饲料和各种单一饲料。 三、仪器设备

1. 实验室用样品粉碎机或研钵。 2. 分样筛，孔径0.45mm（40目）。 3. 分析天平，感量0.0001g。

4. 电热式恒温干燥箱（烘箱），可控温度在105±2℃。 5. 高温电炉，可控温度在550±20℃。 6. 瓷坩埚，Φ30mm。

7. 消煮器（六联电炉），配有冷凝球的高型烧杯（800ml）或有冷凝管的锥形瓶。 8. 干燥器，用变色硅胶或氯化钙作干燥剂。 9. 过滤网，200目不锈钢网。 10. 定量滤纸，中速，Φ12cm。 四、试剂

1. 硫酸（GB 625-89），分析纯，配成5%硫酸溶液。

2. 氢氧化钠（GB 629-81），分析纯，配成5%氢氧化钠溶液。 五、试样的选取与制备

取具有代表性试样，粉碎至40目，用四分法缩减至200g，装于密封容器中，防止试样成分的变化或变质。

六、测定步骤

1. 空坩埚灼烧至恒重（W0）

将干净坩埚放入高温电炉，在550±20℃下灼烧30min，取出，在空气中冷却约1min，然后移入干燥器冷却30min，称重。再同样灼烧，冷却，称重，直至两次称重之差小于0.0005g为恒重。

2. 坩埚+滤纸烘干至恒重（W1）

在已恒重的坩埚中放入一张定量滤纸，然后开盖置于105±2℃烘箱中烘6h，取出，盖好坩埚盖，在干燥器中冷却30min，称重。再同样烘干1h，冷却，称重，直至两次称重之差小于0.001g为恒重。

3. 称样（W）

称取2g左右样品，准确至0.0001g，放入干净的高型烧杯中。 4. 酸碱消煮

将高型烧杯置于消煮器上，加50ml 5%的硫酸溶液，继续加入沸蒸馏水至200ml刻线处，放好冷凝球，立即加热，使其在2min内沸腾，进行酸消煮，保持微沸30±1min，趁热过滤，将残渣转移至不锈钢滤网上，用热蒸馏水冲洗残渣至中性（pH试纸沾取滤液颜色不变则可）。 将残渣放回原高型烧杯中，加50ml 5%的氢氧化钠溶液，继续加入沸蒸馏水至200ml刻线处，放好冷凝球，立即加热，使其在2min内沸腾，进行碱消煮，保持微沸30±1min，趁热过滤，将残渣转移至不锈钢滤网上，用热蒸馏水冲洗残渣至中性（pH试纸沾取滤液颜色不变则可）。

5. 残渣+滤纸+坩埚烘干至恒重（W2）

将酸碱消煮残渣过滤至已恒重的滤纸上，放回原坩埚中，开盖置于105±2℃烘箱中烘6h，取出，盖好坩埚盖，在干燥器中冷却30min，称重。再同样烘干1h，冷却，称重，直至两次称重之差小于0.001g为恒重。

6. 残渣+滤纸+坩埚灼烧至恒重（W3）

将已烘干至恒重的残渣+滤纸+坩埚再置于高温电炉中550±20℃下灼烧30min，取出，在空气中冷却约1min，然后移入干燥器冷却30min，称重。再同样灼烧，冷却，称重，直至两次称重之差小于0.0005g为恒重。

七、结果计算 1. 计算公式

（W2?W1）?（W3?W0）粗纤维（%）??100W

2. 重复性

每个试样至少应取两个平行样进行测定，以其算术平均值为结果。

粗纤维含量≥10%时，允许相对偏差为4%；粗纤维含量＜10%时，允许相差（绝对值）为0.4。

八、注意事项

1. 试样含脂肪小于1%时可不脱脂，含脂肪1%～10%时建议脱脂，含脂肪在10%以上时必须脱脂，或用测定脂肪后的试样残渣。

2. 进行酸煮和碱煮过程中，硫酸和氢氧化钠溶液浓度实际均为1.25%，相当于0.125mol/L的H2SO4和0.313mol/L的NaOH。

3. 在酸煮后和碱煮后冲洗至中性过程中，最好用热蒸馏水，宜于过滤。

4. 定量滤纸与定性滤纸的主要差异在于粗灰分含量不同，定量滤纸粗灰分含量在0.01%，可忽略不计，而定性滤纸粗灰分含量为0.15%左右。

九、其他

除本节介绍饲料中粗纤维含量测定方法外，亦可通过纤维测定仪进行粗纤维的快速测定。

附：饲料中NDF、ADF的快速测定

一、原理

植物性饲料（如一般饲料、牧草和粗饲料）经中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠）分解，大部分细胞内容物溶解于洗涤剂中，其中包括脂肪、糖、淀粉和蛋白质，统称为中性洗涤剂溶解物（NDS），而不溶解的残渣为中性洗涤纤维（NDF），这部分主要是细胞壁部分，如纤维素、半纤维素、木质素、硅酸盐和极少量的蛋白质。

酸性洗涤剂可将中性洗涤纤维（NDF）中各组分进一步分解。植物性饲料可溶于酸性洗涤剂的部分称为酸性洗涤剂溶解物（ADS），主要有中性洗涤剂溶解物（NDS）和半纤维素，剩余的残渣称为酸性洗涤纤维（ADF），其中含有纤维素、木质素和硅酸盐。此外，由中性洗涤纤维（NDF）与酸性洗涤纤维（ADF）值之差即可得到饲料中的半纤维素含量。

酸性洗涤纤维经72%硫酸的消化，则纤维素被溶解，其残渣为木质素和硅酸盐，所以从酸性洗涤纤维（ADF）值中减去72%硫酸消化后残渣部分则为饲料中纤维素的含量。

将经72%硫酸消化后的残渣灰化，灰分则为饲料中硅酸盐的含量，而在灰化中逸出的部分即为酸性洗涤木质素（ADL）的含量。

上述可用图2-1表示。 中性洗涤溶解物NDS 中性洗涤纤维NDF （半纤维素、纤维素、木质素、硅酸盐） 植物性饲料 （蛋白质、脂肪、淀粉、糖） 残渣 （木质素、硅酸盐） 500℃，2h，灰化 中性洗涤纤维NDF （纤维素、木质素、硅酸盐） 72%硫酸 酸性洗涤溶解物ADS （半纤维素） 溶解物 （纤维素） 烧尽（逸出） 酸性洗涤木质素ADL 残渣 （灰分，即硅酸盐）

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