DRR041A(SYBR)TAKARA说明书(8)

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性 95℃ 30秒 20℃/秒 1 Cycle

Stage 2：PCR反应 95℃ 5秒 20℃/秒 60℃ 20秒 20℃/秒 40 Cycles

Stage 3：融解曲线分析 95℃ 0秒 20℃/秒 65℃ 15秒 20℃/秒 95℃ 0秒 0.1℃/秒

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

◆应用Smart Cycler Ⅱ System Real Time PCR扩增仪的操作方法

请按照Smart Cycler®（Cepheid公司）的使用说明书要求进行实验操作。

① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0 μM范围内

调整引物浓度。

*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不

同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。 ② 进行Real Time PCR反应。

PCR反应管请用离心机轻轻离心后放入Smart Cycler II System中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

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