●操作方法
◆应用Thermal Cycler Dice® Real Time System扩增仪的操作方法
请按照Thermal Cycler Dice® Real Time System（TaKaRa Code：TP800）的使用说明书要求进行实验操作。
① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂
SYBR® Premix Ex TaqTM（2×）
PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） DNA模板
dH2O（灭菌蒸馏水）
使用量 12.5 μl0.5 μl0.5 μl 2 μl9.5 μ
l
终浓度 1× 0.2 μM*10.2 μM*1
*2
Total 25 μl*3*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1～1.0
μM范围内调整引物浓度。
*2 DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷
贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。
如果欲使用本制品进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。 *3 建议反应液体积为25 μl。 ② 进行Real Time PCR反应。
建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条
。 件的选择」 两步法PCR扩增标准程序： Stage 1：预变性 Repeat：1 95℃ 30秒 Stage 2：PCR反应 Repeat：40 95℃ 5秒 60℃ 30秒 Stage 3：Dissociation
◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。
③ 实验结果分析。
反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。
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