生物下游技术试题(16)

1.迅速加工,缩短停留时间, 0.5分

2.控制好操作温度和pH, 0.5分

3.减少或避免与空气接触受污染的机会, 0.5分

4.总体设计好各组分的分离顺序. 0.5分

3. 什么叫吸附等温线?研究吸附等温线有什么意义?

答：吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。2分

研究吸附等温线可以提供得到以下方面的信息：

预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状；1分

为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件；1分

反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型及吸附状态。1分

建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。1分

4. 简述凝胶色谱的分离原理是什么？有哪些用途？

答：排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。3分

用途：分离纯化，脱盐，分子量的测定。（各1分，共3分）

5. 非线性色谱的概念及其特点?

答：非线性色谱: 流动相中的样品浓度(Cm)与固定相中的样品浓度(Cs)不呈线性关系的色谱.分析色谱大多属于线性色谱;制备色谱大多属于非线性色谱. 3分

非线性色谱的特点:

样品的保留值可变:非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化; 1分

峰形的不对称性:不是高斯正态分布的; 1分

色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高增加的速率随浓度的增加而下降. 1分

四. 实验设计题（每小题5分，共10分）

1．从牛血清中提取牛血清蛋白并分离纯化。

离心------盐析-------透析-------凝胶过滤层析 （电泳）各1.5分

2．已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90 C加热3~4 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的步骤和理由，以及检测方法。

脑组织匀浆破碎（添加蛋白酶抑制剂 ）——离心（使之澄清）——凝胶过滤层析、亲和层析、疏水作用层析 ——等电聚焦电泳。初始阶段、中间阶段各2分，、精制阶段1分。

五．论述题（每小题10分，共20分）

1．试述包含体复性的基本过程,复性过程错误发生的主要原因是什么?举例分析主要的复性方法的优缺点,为什么LC复性是最好的?

答：包含体复性的基本过程：

①

②

分

③ 溶解：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。去污剂可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋分离包含体：第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然洗涤：包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍后5000~20000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离 。1分 等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解。1

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