酶类实验测定方法(2)

2. 30％H2O2

3. 愈创木酚（2-甲氧基酚） 三、步骤 1. 酶液提取

称取0.5g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为酶粗提液。 2. 酶活性测定

（1）反应混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液于烧杯中，加入28μl愈创木酚（2-甲氧基酚）于磁力搅拌器上加热搅拌，直至溶解，待溶液冷却后加入19μl30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。

（2）酶活性测定：取3ml反应液并加入40μl酶液后测定OD470值每30s的变化，记4次数。以PBS代替酶液为对照调零， 3. 计算结果

以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。，按下式计算活性 POD活性=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)

ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。 四、注意事项

1. 反应液配制时由于愈创木酚难溶，应加热一段时间。加入H2O2前注意溶液冷却，防止H2O2的挥发。

2. 由于该反应迅速，加入酶液要立即进行吸光值的测定。 五、参考文献

李合生.植物生理生化实验原理和技术M.高等教育出版社，2000：267～268

五过氧化氢酶（CAT）的测定

一、原理

过氧化氢酶(Catalase,CAT),是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能催化H2O2分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。H2O2在240nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。

二、试剂

1 0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）： 取A母液(Na2HPO4) 228.75 ml 和B母液(NaH2PO4) 146.25 ml混合后用蒸馏水定容至500ml。

2. 30％H2O2 三、步骤

1. 酶液提取

称取0.5g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为CAT粗提液。

2 酶活性测定

（1）反应混合液的配制：取100ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.05ml 30%的H2O2摇匀即可。

（2）取2.9 ml反应液加入0.1ml酶液，以PBS为对照调零，测定OD240值每30s的变化，记4次数。

3 结果计算：酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。 CAT=[ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） (u/g FW)

ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）。 四、注意事项

H2O2易分解，应现用现配。 五、参考文献

李合生.植物生理生化实验原理和技术M.高等教育出版社，2000：267～268

六抗坏血酸过氧化物酶（APX）的测定

一、原理

AsA-POD是叶绿体内专一的清除H2O2的酶，催化抗坏血酸(AsA)与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸（MDAsA）。随着AsA被氧化，溶液的OD290值下降，根据单位时间内OD290的减少值，计算AsA-POD活性。AsA氧化量按消光系数2.8/(mmol/L)·cm（ε＝2.8mM-1.cm-1）计算，酶活性用μmol AsA·g/FW·h 表示。 二、试剂

（按50个样计算）：

1. 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）的配制：母液的配制方法同前取A母液Na2HPO4 61.0ml，加入B母液NaH2PO4 39.0ml，用去离子水定容到400ml。

2. 0.1 mM EDTA-Na2：取0.0093g EDTA-Na2用PBS（pH7.0）缓冲液定容到250ml（372.24 g/M×0.1mM×500ml=0.01861 g）；

3. 5 mM AsA：取0.044g抗坏血酸用PBS（pH7.0）缓冲液缓冲液定容到50ml（现用现配）；

4. 20 mM H2O2：取0.2ml30% H2O2用去离子水稀释到100ml。 三、步骤

1. 酶液提取方法同SOD. 2. 酶活性的测定

以3 ml体系测定，则取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入2.60 ml 含0.1mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.15ml 5 mM的AsA，最后加入0.15 ml 20mM H2O2，立即在20℃下测定OD290值每30s的变化（测定时间内变化大可测定的时间短点，否则长点），共计四次。

3. 酶活性计算

以1min内A290变0.01定义为一个酶活性单位u，酶活性以u/g(FW)表示 APX活性（u/g）= △A290.VT/0.01VS.t.W △A290表示在290nm处吸光值的变化

VT 提取液总体积；VS 酶液的体积；W叶片的鲜重 ；t反应时间

VC-POD活性（umolVC.g-1FW.h-1）=（△A*Vt*v*60*1000)/(FW*Vs*2.8*t) 式中：Vt：酶液总体积（ml）；FW;样品鲜重（g）；Vs：测定时取酶液的量（ml）；v：反应液体积（ml）；△A;A290 0-30s的差值；t：反应时间min；2.8：VC的毫摩尔消光系数（2.8mM.cm） 四、注意事项

加入H2O2后应混匀反应液然后快速进行比色测定。 五、参考文献

高俊凤.植物生理学实验指导M.高等教育出版社，2006：221～223

计算公式：

△OD/△t×Vr×VT A×d×Vt×W

△OD为反应时间内吸光度的变化（40秒吸光度－0秒吸光度）；△t为反应时间（40秒）；

-1

-1

Vr为反应

液体积（2mL）；VT提取液体积（1.6mL）；A为消光系数（2.8mM-1.cm-1）；d为比色杯厚度

（1cm）；Vt测定液体积（0.1mL）；W为样品鲜重（0.2g）。

七羟胺氧化法测定超氧阴离子产生速率

一、原理

O2与羟胺反应产生NO2，NO2在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm处有最大光吸收，根据OD530可计算出样品中的O2的含量。 二、试剂

1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

2. 10mM盐酸羟胺：称取0.05g盐酸羟胺用蒸馏水定容至100ml。

3. 17mM对氨基苯磺酸(磺胺酸、4-苯胺磺酸)C6H7NO3S，173.20：称取0.2944g对氨基苯磺酸用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=1：3）定容至100ml

4. 7mM α-萘胺：称取0.1002g萘胺用冰醋酸溶液（冰醋酸：水=3：1）定容至100ml。 5. 亚硝酸钠 三、步骤 1. 酶液提取

称取0.5g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶粗提液。 2. 亚硝酸根标准曲线的制作

2.1系列浓度NaNO2溶液的配制

取50nmol·mlNaNO2母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol·ml的标准稀释液。

2.2取7支试管，编0～6号，分别加10、15、20、30、40、50、nmol·ml1NaNO2标

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－1

－1

--－

－

准稀释液1ml，0号管加蒸馏水1ml，然后各管再加50mmol·L

－1

－

－1

磷酸缓冲液1ml，17 mmol·L

对氨基苯磺酸1ml和7 mmol·L1α-萘胺1ml，置于25℃显色20min后，以0号管作空白

对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。

方法二：标准曲线的制备：取亚硝酸钠6.9 g定容至1000ml，为0.1 mol/L亚硝酸钠溶液，分别取2.5、5、7.5、10、12.5 ml定容至50 ml，制成5、10、15、20、25 mmol/L的标准溶液。取各标准溶液各1 mL，重复以上测定的步骤，于波长530 nm测定OD值，以OD值为纵坐标，亚硝酸钠浓度（mmol/L）为横坐标绘制标准曲线。

高俊凤：称取NaNO2（AR级）0.1g蒸馏水定容至100ml，摇匀后取5ml用蒸馏水定容至1000ml即为5mg/l的标准液。

2.3 标准曲线绘制

以1～6号管亚硝酸根（NO）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。 3. O2产生速率测定

（1）取0.5ml提取液中加入0.5ml PBS(0.05M，pH7.8)，1ml 10mM盐酸羟胺溶液后摇匀，同时做一对照管以PBS代替样品提取液；

（2）在25℃下保温1小时，若测定叶片保温后需加入2ml乙醚萃取Chl；

（3）依次先加入1ml 17mM对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mMα-萘胺，混合后涡旋；

（4）在25℃下保温20min后在3000g离心3min，（或置于冰箱待测）； （5）以对照管调零,取粉红色水相液测定OD530。 4. 计算结果

--根据测得的OD530，查NO2-标准曲线得到[NO2-]，依照羟胺与O2的反应式：NH2OH＋2O2+--＋HNO2-＋H2O2 ＋H2O 计算[O2]，即[NO2-]×2=[O2]。再根据样品与羟胺反应的时间和样品

--1-1-1-1

中的蛋白质含量，求得O2产生速率（nmol minmg蛋白，也可用nmol ming鲜重）。

－

根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2浓度，按公式（1）即可计算出样

－－－－

品中NO2浓度。然后依据羟胺与O2的上述反应，从NO2对O2进行化学计量，按公式（2）

－－

计算，即将按公式（1）计算得到的NO2浓度乘2，得O2浓度。也可根据被测样品与羟胺反

－

应的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得O2的生产率。

－

从标准曲线查得NO2（nmol）×提取液总量（ml）

－－1

NO2含量（nmol·gFw）=——————————————————————…（1） 样品重（g）×测定时提取液用量（ml）

－－

将所得NO2含量代入下式计算，即求出O2含量。 －－－1

O2含量= NO2（nmol·gFw）×2 ……………………………………………… （2）

－－

将公式（2）所得的O2浓度及样品中蛋白质含量，依下式计算出O2产生速率。

－

O2（nmol）

－－1－1

O2产生速率（nmol·mg蛋白·min）= ———————————————…（3）

-2－

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