验 方
李菁华 2016.6
法
实
一叶片相对含水量（RWC）采用烘干称重法测定
将叶片称鲜重（Fw）等量两份，然后一份浸入去离子水8h后称其饱和鲜重（Tw），将另一份材料于105℃烘箱中杀青30min，再在80℃下烘干48h至恒重记为干重（Dw），按如下公式计算 （Fw-Dw） 叶片相对含水量（%）= ×100% （Tw-Dw）
邹琦.植物生理学实验指导M .北京：中国农业出版社，2000
二根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法测定
一、原理
氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。
二、试剂
1）乙酸乙酯（分析纯）
2）连二亚硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末，俗称保险粉。
3）0.4%TTC（又名红四氮唑、2,3,5-氯化三苯基四氮唑）溶液：准确称取TTC0.4g，溶于少量水中，定容到100ml。
4）磷酸缓冲液（1/15mol·L，pH7.0）:
A液：称取纯Na2HPO4·2H2O 11.876g溶于蒸馏水中成1000ml。 B液：称取纯KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中成1000ml。 用时取A液60ml，B液40ml混合即成。
5）1mol·L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸5.5ml，边搅拌边加入盛有100ml蒸馏水的烧杯中，冷却定容至100ml。
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三、实验步骤
1）TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml容量瓶中，加少许Na2S2O4
粉摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、
0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以乙酸乙酯作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2）取出大豆根系洗净，用滤纸吸干水分，称取1cm长的根尖样品0.2g，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液各5ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h（2h），此后加入1mol·L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，10min后其他操作同上）。
3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3-4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出TTF。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2-3次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白实验作参比读出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量
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四、结果计算
四氮唑还原强度（mg·g根鲜重h）＝四氮唑还原量（mg）/根重（g）×时间（h）
王晶英，敖红，张杰，曲桂琴.植物生理生化实验技术与原理M .哈尔滨：东北林业大学出版社，2003.7
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三氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）
一、原理
SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：
由于超氧自由基（O2）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2
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.
.－
，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲臜（黄 色），继而还原生成二
甲臜，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲臜生成速度减慢。通过
+
在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。
二、试剂
1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取1.0818g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至500ml。 3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。 4. 60μM核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。 三、实验步骤
1. 酶液提取
称取0.5g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清夜即为SOD粗提液。
2. 酶活性测定
（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液6ml， NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀；
（2）分别取2.9ml反应混合液和0.1ml（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加2.9ml反应混合液和0.1ml PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加2.9ml反应混合液和0.1ml PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。
（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25℃下反应20min；
（4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560） 3. 计算结果
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位（U），按下式计算活性 n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2
SOD总活性＝ [( Ack-AE)×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。
四、注意事项
1. 酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降； 2. 植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。
3. NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。
4. 加反应液时最好在暗光下进行；
5. 核黄素产生O2，NBT还原为蓝甲臜都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40μmolms，同时使照光时间一样，选择试管尽量一致，照光结束后测一个拿一个（最好晚上做）（温度高时照光时间缩短，温度低时延长）；
6. 测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。（一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量，即以能抑制反应50％的酶量为一个SOD酶活性单位。）
（反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。李合生方法：2支CK管均以缓冲液代替酶液。） 五、参考文献
王晶英，敖红，张杰，曲桂琴.植物生理生化实验技术与原理M .哈尔滨：东北林业大学出版社，2003.7
李合生.植物生理生化实验原理和技术M.高等教育出版社，2000：267～268
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四愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）
一、原理
在过氧化物酶催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm下吸光值变化测定过氧化物酶活性。 二、试剂
1. 0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：
A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.2mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)的配制：分别取A母液(Na2HPO4 )12.3ml和B母液(NaH2PO4 ) 87.7ml混匀即为100mlPBS(0.2M，pH6.0)。
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