毕业设计正文（改完版）-李云浩(1) - 图文(4)

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验成本低,而且是一种简单易操作地检测细胞运动能力的基本方法，常用于评价肿瘤细胞的侵袭转移能力。

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3 研究方法

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料 试剂：蒸馏水；

无水乙醇（分析纯）； 浓硫酸（分析纯）； 氯仿（分析纯）； 葡萄糖（分析纯）； 正丁醇（分析纯）； 蒽酮（分析纯）；

药材：干地木耳（青海海东地区野生地木耳）； 3.1.2 仪器

紫外分光光度计（上海分析仪器厂，型号721）；

多功电子恒温水浴锅（上海凯乐电紫设备厂，型号SYG系列）； 电子分析天平（上海明桥精密仪器有限公司，型号FA1004N）； 低速台式离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司，型号:FYL-YS-30L ）。 旋转蒸发器（型号为RE—2000A，巩义市予华仪器有限公司）； 双人净化工作台（型号为HJ—CJ—2D,）；

3.2 地木耳多糖的提取

3.2.1 绘制标准曲线 (1）标准曲线的制作：

2g/L蒽酮试剂:溶解2g蒽酮于浓H2SO4（A.R.95.5%），现配现用。0.1g/L葡萄糖溶液：准确称取标准葡萄糖0.01g，用少量蒸馏水溶解后定容至100mL容量瓶中。

分别取0.1g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，然后向其中加入双蒸水配制至1.00mL；分别加入4.00mL蒽酮试剂，放置在冰水浴中迅速冷却，然后再沸水浴，直至在沸水浴中煮沸，管口应该密封完好，以防试剂挥发。煮沸持续10分钟，然后将其取出，快速冷却至室温，放置大约10min，在可见光分光光度计620nm处进行比色比色。空白项是以相同方法处理的蒸馏水，

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然后比色。在标准曲线上找到光密度值所对应的糖浓度。以糖的含量（μg）为横坐标，OD值为纵坐标，自作出标准曲线。 3.2.2 地木耳的提取

准确称取地木耳粉末20.00g放入1000ml的原地烧瓶中，加入700ml的蒸馏水。连接好冷凝装置。将装置放入90℃的水浴锅中固定，连续提取3个小时，将提取液过滤，滤渣放入瓶中继续提取2个小时，滤出滤液。合并上清液，减压过滤后再利用旋转蒸发仪将上清液浓缩至20ml。加入60ml的无水乙醇，搅匀，静置在4℃低温冰箱过夜。

3.2.3 Sevage试剂除蛋白纯化及浓缩

取出地木耳多糖溶液，放入2000G，10℃高速离心机中离心15分钟，收集沉淀物。取地木耳多糖沉淀物加入4mLSavege试剂在振荡器中震荡20min，静置，取上清液，弃去下层溶液。再加入4mLSavege试剂，相同操作连续5次。除蛋白后放入减压干燥箱40℃烘干成粉，密封保存。 3.2.4 地木耳多糖提取率及其含量的测定

（1）地木耳多糖的测定：

将地木耳多糖稀释，取出1mL加入4mL蒽酮试剂，放置在冰水浴中迅速冷却，然后再沸水浴，直至在沸水浴中煮沸，管口应该密封完好，以防试剂挥发。煮沸持续10分钟，然后将其取出，快速冷却至室温，放置大约10min，在可见光分光光度计620nm处进行比色比色。空白项是以相同方法处理的蒸馏水，然后比色。在标准曲线上找到光密度值所对应的糖浓度。

（2）提取率及纯度测定：提取率的计算：用测得的多糖质量除以20.00克，即为多糖的提取率。

3.3 多糖溶液的配制

取出去除蛋白后的地木耳多糖干燥粉末0.4035g，加入2.36ml蒸馏水，和2.60ml的pbs缓冲液以及双抗，溶解成溶液。分别配制成10μg/ml,20μg/ml和40μg/ml三种浓度的地木耳多糖溶液，放置在37℃的恒温培养箱。

3.4 HeLa细胞分板培养及划痕实验

3.4.1 试剂及设备

胰蛋白酶，青霉素和链霉素，二甲亚砜（DMSO）（sigma，USA），DMEM，胰

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酶（GBICO，USA），胎牛血清(碧云天)，单人单面净化工作台（苏州净化，中国），饱和湿度二氧化碳培养箱（Thermal Scientific,USA），倒置显微镜。 3.4.2 细胞培养 复苏：1.取出

摘 要

目的：地木耳(Nostoc commune vauch)是属于藻类蓝藻纲念珠藻科(Nostocaceae)，

全球广泛分布，资源十分丰富。已有研究表明地木耳含有丰富的氨基酸、糖苷、维生素、钙、磷等，在抑菌、抗氧等方面具有很高的活性。而近些年来，有很多关于多种植物、真菌多糖抗肿瘤领域的研究。随着地木耳以药材的身份逐渐走入了研究人员的视野，地木耳多糖的药理药效也开始得到重视。本课题拟针对地木耳多糖的抗肿瘤活性开展研究。

宫颈癌是女性患者常见的恶性肿瘤之一，原位癌高发的年龄为30～35

岁，浸润癌为45～55岁，而且近年来其发病更有向年轻女性发展的趋势，已是女性患者的一大杀手，而肿瘤细胞的侵袭和转移是导致放疗、化疗失败的主要因素。本实验利用多糖组和对照组宫颈癌细胞培养，并通过划痕实验，确定地木耳多糖对宫颈癌细胞侵袭的作用效果。

方法：首先，用水醇法按照60：1液料比，温度控制在90℃，反复提取三次，合

并提取液抽滤，并进行浓缩。加入无水乙醇，低温过夜。离心，取沉淀，并用savege试剂去除蛋白，干燥成粉末。然后绘制葡萄糖标准曲线，测出提取多糖的含量。将地木耳多糖配制成三种不同浓度溶液，加入宫颈癌HeLa细胞培养皿中，进行划痕实验，培养0、6、12、24、48小时后观察划痕的修复。最后进行统计学处理。

结果: 本实验利用水提法对地木耳进行提取，提取率为7.86%。地木耳多糖有抑制

宫颈癌Hela细胞侵袭的作用，在三种浓度中，40μg/ml的抑制效果强，并且具有剂量依赖性。

结论：地木耳多糖可抑制宫颈癌Hela细胞的侵袭能力，有望用于宫颈癌的治疗。 关键词：地木耳 多糖 宫颈癌 侵袭

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Abstract

Objective：Nostoc commune Vauch commonly known as Nostoc commune, Nostoc commune is a global wide species, mainly distributed in Karst karst area and limestone karstzone in Karst district. Nostoc contains a lot of amino acid, glucoside, vitamin, calcium, phosphorus. In recent years, there are many researches on polysaccharides efficacy in this direction. With the fungus medicine identity gradually into there search field of vision, pharmacological effect of polysaccharides of Nostoc commune also get attention.

Cervical cancer is one of the most common malignant tumor of female patients, in some cancer at the age of 30 to 35 years of age, invasive carcinoma was 45 ~ 55 years old, and more in recent years the incidence to the development trend of young women. Tumor invasion and metastasis is one of the main lethal factor. This experiment using polysaccharide group and control group to determine the effect on cultured cervical cancer cells.

Methods: Firstly, water alcohol method according to the 60:1 ratio of liquid to solid, temperature control in 90 ℃, repeated extraction. Repeated three times of extraction, merging the extracted liquid filtration, and concentrating. Adding anhydrous ethanol, cold night. Centrifugal, and precipitation, and Savege reagent was used to remove protein, drying into powder. Secondly, draw the standard curve of glucose, measure the content of polysaccharides extracted from. The fungus polysaccharide preparation of three different concentration solutions, adding to cervical cancer HeLa cell culture dishes. For wounding healing test, HeLa cell cultured for 0, 6, 12, 24, 48 hours. Finally, statistical analysis.

Results: To the Nostoc polysaccharide solution inhibited the invasive cervical carcinoma Hela cells, and 40μg/ml of the strongest inhibitory effect of the Nostoc polysaccharide.

Conclusion: after the processing, compared with the control group, the experimental findings, Nostoc polysaccharide solution, reduce the ability of cells to repair the scratches, as shown in figure shows more of Nostoc polysaccharide suppresses the motion ability of cervical cancer cell line. Key words: Nostoc commune polysaccharide cervical cancer invade

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