第四章 生物产品萃取技术(6)

平衡后，两相中待测物浓度关系如下式：

Ns＝KVsVoCo／(KVs十Vo) (1)

式中Ns为固定相中待测物的分子数；K为两相间待测物的分配系数，Vs为固定液体积；Vo为样品体积；Co为样品中待测物浓度。因为Vo>>Vs，故等式(1)可简化为：

Ns=KVsCo (2)

由等式(2)可知，固定液吸附待测物分子数与样品中待测物浓度呈线性关系，即样品中待测物浓度越高，SPME吸附萃取的分子数越多。当样品中待测物浓度一定时，萃取分子数主要取决于固定液体积和分配系数。同时，方法的灵敏度和线性范围的大小也取决于这两个参数。固定液厚度越大(即Vs越大)，萃取选择性越高(K越大)，则方法的灵敏度越高。由此可见，选择合适的固定液对于萃取结果是很重要的。

目前，SPME装置已实现商品化。主要由两部分组成：一部分是作为支撑用的微量注射器底座；另一部分是类似于注射针头形状的熔融石英纤维，其半径一般为15mm左右，上面涂布着固定体积(厚度为10一100um)的聚合物固定液。操作时，只需将熔融石英纤维插入样品或样品上层气体(即顶空)中，平衡一段时间，使需萃取物富集于固定液后，即可取出直接进样至GC或HPLC仪中进行分析。

4. 4．2 固相萃取的操作 4. 4．2．1萃取头操作

萃取头操作参见表4

表4 SPME萃取头分类及应用范围

非极性 极性 其他 聚二甲基硅氧烷(PDMS) 聚丙烯酸酯(PARL) 活性炭 厚膜(100um)适于分折水溶液中低温点、低极性的物质 适于分析极低适于分离酚等强极应用范围 薄膜(7um)适于分析中等沸点和沸点的强亲脂性化合物 高沸点的物质，如苯甲酸酷、多性物质 环芳烃等 类别 举例 4.3. 2.2 样品富集方式

样品富集[7-9]见表5

表5 SPME样品富集方式

富集方式 优点 直接法 吸附量大 顶空法 较好的方法，可用于有大分子干扰的样品，广泛适用于多种类型的样品，包括固态样品、非匀质混悬液等 26

有大分子干扰时基线不吸附量小，当待测物具有较高沸点(约大于稳，有杂峰 450℃)时，此法耗时长且灵敏度较低。 不适用范围 有大分子干扰的样品 样品中待测物沸点较高 缺憾 SPME法不用或少用溶剂，熔融石英纤维可重复使用上百次，既降低成本又利于环境保护，操作简便，易于自动化和与其他技术在线联用。与其他常用技术相比，克服了许多缺点：如传统的液—液萃取法需使用大量溶剂和样品、处理时间长；以溶剂脱附的固相萃取法回收率低；热脱附的固相萃取法需要专用的加热装置，且固体吸附剂的孔隙易被堵塞的缺点；超临界流体萃取装置价格昂贵，不适于水样分析。SPME法与其他萃取方法的比较见表6。

表6 SPME法与其他萃取方法的比较

[10]

4.3.1.1. 不同过程的影响因素见表7

表7 不同过程影响因素

萃取时间[9] 解吸过程[7] 分配系数、物质的扩散速度、影响搅拌，温度，顶进样口温度，解吸时间，样品基质、样品体积、萃取因素 空体积大小 起始柱温，待测物的性质 头膜厚度 提高萃取量的方法[11-13]：（1）萃取过程涉及涂层和基质对被萃物的竞争吸附，通过合适的手段增加涂层对样品的亲和性，减少基质对样品的亲和性，使萃取平衡向萃取方向移动，可以增大萃取量。（2）还可以在萃取涂层中加入衍生试剂，使极性化合物在萃取的同时，现场衍生成极性较小的物种，有利于萃取和随后的色谱分析。（3）调整液相样品的PH值或加入盐分，泥土样品加入适量水或表面活性物质，都可以有效地增加萃取量。（4）温度是对SPME影响较为复杂的因素，存在一个合适的操作温度。最理想的方法是在加热样品的同时，冷却涂层到室温，则使常温下无法萃取的物质都可得到定量萃取。（5）搅拌：促进样品均一化，尽快达到分配平衡。

顶空取样[8] 27

4.4 .4 固相萃取的应用

SPME法最初只用于环境化学中易挥发化合物的提取分析，随着方法本身的不断完善，现已逐步发展到食品、医药卫生、临床化学、生物化学、法医学等领域[9,13-16]。最近已由挥发性物质的提取发展到不具挥发性的除草剂，日本把样品基质由污水发展到血和尿，成功地提取了尿中的烟碱[9]。固相微萃取已应用于牛血清清蛋白的分析中[17] 。SPME应用于分析环境中挥发性有机物、杀虫剂、酚类等[13-14],农药残留[15]。

SPME—GC联用不适于热不稳定化合物及表面活性剂、药物、蛋白质等半挥发和不挥发组分的分析，而SPME-HPLC联用可以解决其局限性，扩大SPME的应用范围。还有与分光光度计、红外光谱、电解分析、毛细管电泳、SPME-ICP-MS、SPME-微波辅助萃取-GC等多种联用方式[8

，18]

。

用SPME—GC—MS检测半胱氨酸、胱氨酸和蛋氨酸的方法。Liao等人已实现了用SME-微量LC方法萃取和分离蛋白质,向我们展示了SPME分析蛋白质化合物的潜力[19]。

今后努力的方向在发展更新更好的纤维涂层以获得更好的选择性，如微型吸附搅拌棒,与膜技术、抗体技术、传感器及分子标记聚合物等结合如笼形分子的萃取纤维层，研制各种专用纤维，促进其应用[7,19-20]。现已有内涂固定相的毛细管萃取柱和热解吸方式[20]，它对于难挥发性物质的分析，In-tube-SPME-HPLC的方法简单方便且灵敏准确，因此会在生化、药物、食品领域有很广阔的应用发展前景。

4.5超临界萃取

4. 5．1 超临界萃取的原理

超临界流体萃取（SFE）技术应用领域相当广泛，特别对分离或生产高经济价值的产品，如药品、食品和精细化工产品等有着广阔的应用前景。特别适用于食品、中草药中某些热敏性物料的萃取。C02超临界流体萃取在在医药领域该技术广泛用于酶和维生素的精制，酵母、菌体生产物的萃取，医药品原料的浓缩、精制、脱溶剂，脂肪类混合物的分离精制及动植物体内药物成分的提取等各个方面。在生物工程中还可代替脂溶性的有机溶剂进行酶化反应。国内已在实验室开发了月桂酸丁酯、油酸油脂，淀粉水解制取葡萄糖等酯化反应技术。也有利用该技术进行生物活性物质的提取，手性药物的制备。

超临界流体具有萃取和精馏双重性，具有低温处理，不发生氧化变质，萃取效率高，没有溶剂残留和可选择性分离等优点。

局限性：缺乏生物化合物在超临界CO 2中的溶解度和相平衡数据，这就使工艺设

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计不好把握，需经多次实验来获得必要的数据。较适合萃取脂溶性、分子量小的物质，对极性大、分子量太大的物质工业化生产有一定难度。目前国内设备装置投资大。

开发超临界多元流体的分步选择性萃取、重组萃取及精馏萃取新工艺 [28]；精确可靠的模拟、设计技术的需求以及热力学数据的进一步充实；利用整合剂与带电的离子生成的超临界流体整合物提高萃取率和生物兼容性[29]；将目前固定床的间歇式操作考虑采用移动床及流化床进行连续操作[23]是今后的发展方向。

4. 6．超声和微波萃取 4. 6．1超声萃取

4. 6.1．1 超声波萃取的原理

超声波在媒质中传播可使媒质质点在其传播空间内进入振动状态强化溶质扩散、传质,即超声波机制。超声波在媒质质点传播过程中其能量不断被媒质质点吸收变成热能,导致媒质质点温度升高,即超声波热学机制。同时当大量的超声波作用于提取介质,当振动处于稀释状态时,介质被撕裂成许多小空穴,这些小空穴瞬时闭合,闭合时产生高达几千大气压的瞬时压力,即空化现象。

在超声场中由于被破碎物等所处的提取介质中含有大量的溶解气体及微小的杂质,它们包围在被破碎物等的胶质外膜周围,为超声波作用提供了必要条件。空气中产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂,而且整个破裂过程在瞬时完成,同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放扩散及溶解。超声波破碎过程是一个物理过程,浸提过程中无化学反应,被浸提的生物活性物质在短时间内保持不变,生物活性不减,同时提高了破碎速度,缩短了破碎时间,可极大地提高提取效率。除空化作用外,超声波还具有机械振动、乳化、扩散、击碎等多级效应,有利于使细胞中的目标分子的转移,并充分和溶剂混合,促进提取的进行。另外超声波的凝聚作用也不容忽视,超声波有使悬浮于气体或液体中的微粒聚集成较大颗粒而沉淀的作用。

使用超声波作用时其效果不仅取决于超声波的强度和频率,而且与被破碎物的结构功能有一定的关系。计算表明:在水中当超声波辐射面上强度达3000W/m2时就会产生空化,气泡在瞬间就很快闭合,闭合时产生的压力脉冲形成瞬间的球形冲击波,从而导致被破碎生物体及细胞的完全破裂,从理论上确定被碎物所处介质中气泡大小后即可选择适宜的超声波频率。由于提取介质中气泡尺寸不是单一的,而是存在一个分布范围,所以超声波频率应有一定范围的变化,即有一个带宽。

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超声提取法是一种利用外场介入强化提取过程，用溶媒进行天然药物中活性有机物成分提取的一种方法。超声能量与物质问有一种独特的作用方式——超声空化。空化作用产生局部的高温高压、能增强物质在溶剂中溶解能力，引起体系的宏观湍动和固体颗粒的高速碰撞，传质速率增大。超声提取时间短、条件温和[23]；与传统的BCR提取法相比也要高效得多[24]。在生化中超声波常被用于破壁，以使胞内产物得以释放。

超声波技术应用于生物技术是一个较新的研究领域；超声波在高分子降解、有机合成、提取分离方面得到了广泛的研究和应用，如多糖的降解与提取。目前对超声波从陆地植物中提取药用有效成分进行了研究，都取得了较满意的效果，回收率大大提高，如用超声波技术提取青蒿素；超声波用于海藻破碎提取海洋生物活性物质亦取得了较好的效果[]。近年来,人们也用超声波技术提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆液的毒质等,超声波提取比常规提取法费时少、得率高,化学成分与常规法相比没有变化，而且具有能耗低、不破坏有效成分的特点[]。由于超声波其独特的优点，必将能在各个行业的分离纯化中得到广泛的应用，使这项技术越发成熟拥有广阔的应用前景。

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4. 6．1．2超声波萃取的影响因素

1 超声波输出功率的影响

输出功率反映了超声波能量的大小，与超声波破碎的效果密切相关。超声波的能量越大，空化作用就更强更有利于细胞的破碎 2 细胞浓度的影响

细胞浓度影响液体的粘稠度。从而会影响超声波在液体中的空化效应。因为细胞浓度高，则液体的粘稠度大，这可能不利于空化泡的形成及其膨胀和爆炸的作用，使破碎效果差。但细胞浓度也不能太低，如低于1 2%，破碎率反而会降低。 3 超声波每次辐射时间的影响

采用较短的辐射时间及多次超声波辐射的工作方式有利于细胞破碎，而延长每次超声波辐射时间、减少辐射次数的工作方式使破碎率明显降低。超声波通过空化效应破碎细胞的过程实际就是空化泡的形成、振动、膨胀、压缩和崩溃闭合的过程,这一过程需要一段极为短暂的时间来完成，短时多次的工作方式能使超声波产生的空化泡有足够的时间和更多的机会完成膨胀和爆炸的过程，因此有利于细胞破碎。不过，每次辐射时间低于2ｓ，破碎率反而会显著下降。

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