溶于反胶团的“水池”中，由于水和表面活性剂在蛋白质表面形成一层“水壳”，使蛋白质不与有机相接触而得到有效保护[1]。蛋白质进入反胶团是一协同过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质分子发生静电吸引而变形，接着两界面形成含有蛋白质的反胶团，然后扩散到有机相中，从而实现了蛋白质的萃取。改变水相条件（如pH值、离子种类或离子强度），又可使蛋白质从有机相中返回到水相中，实现反萃取过程。反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理[2]。如图所示
含水量是反胶团的一重要参数，决定反胶团物理性质，决定其大小和每个胶团中所含表面活性剂的个数。含水量值与表面活性剂的种类，助表面活性剂，水相中盐的种类和浓度有关[4]。 反胶团萃取的特点：
（1）对生物活性分子变性较少，特别适合蛋白质的分离纯化
（2）萃取效率高，选择性和收率高
（3）成本低，容易放大，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。
4.2.2 反胶团体系分类、制备方法和影响因素 4.2．2．1反胶团体系分类 反胶团体系如见表2：
表2 反胶团体系分类及应用举例[1-3]
类别 表面活性剂 特点 应用 16
阴离子表面活性剂 单一表面活性剂 阳离子表面活性剂 非离子型表面活性剂 两种或两种以上表面活性剂构成 少量亲和配基加入表面活性剂 结构简单稳定，反胶团体积相对较大，适于等电点较高的较AOT，DOLPA 小相对分子质量蛋白质，但对分子量大于30000的酶则不易分离 CTAB，TOMAC TritonX AOT/异辛烷/水体可用于分离核糖核酸酶、细胞色素C、溶菌酶 TOMAC/异辛烷等电点较低的较大相对分子体系可用于α-淀质量蛋白质 粉酶的浓缩 能构成更大的反胶团，但这类体系容易乳化 —— 混合表面活性剂反胶团 一般来说，其对蛋白质有更高AOT/DEHPA 的分离效率。非离子表面活性AOT/Tween 85 剂的加入可使反胶团变大，从AOT/DOLPA 而可萃取相对分子质量更大的蛋白质。 AOT/DEHPA体系可萃取牛血红蛋白 亲和反胶团 极少量三嗪蓝染具有亲和特性的助剂，往往极蓝染料为配基，料CB加入CTAB少量亲和配基的加入就会使加入到CTAB体系中可萃取原萃取蛋白质的选择性大大提中 不被萃取的牛血高 清白蛋白
4.2.2. 2反胶团制备
反胶团制备方法主要包括以下几种[4]：
（1） 相转移法：一般把含有表面活性剂的有机相与含有蛋白质的水相接触，通过搅拌，
蛋白质会缓慢地从水相转移到有机相中。形成的最终体系是稳定的，且可能在低含水量下得到高蛋白浓度。
（2） 注射法：最常用方法。蛋白质溶液直接注入含有表面活性剂的有机相中，搅拌成
光学澄清的溶液。易控制水的含量和水核的尺寸。
（3） 溶解法：用反胶团溶液与固体蛋白质粉末接触来使蛋白质进入反胶团。适用于水
不溶性蛋白质。 4.2. 2. 3 影响萃取的主要因素
影响反胶团萃取生物分子的主要因素有水相的pH值、水相的离子强度、表面活性剂的种类和浓度、助表面活性剂、蛋白质的性质和浓度、有机溶剂的种类和温度等因素见表3
表3 影响萃取蛋白质的主要因素[2]
与反胶团有关因素 与水相有关因素 17
与目标蛋白有关因素 与环境有关因素 表面活性剂种类 PH值 蛋白质的等电点 系统的温度 表面活性剂浓度 离子的种类 蛋白质的大小 系统的压力 有机溶剂种类 离子的强度 蛋白质的浓度 助表面活性剂及其浓度 蛋白质表面电荷 生物分子溶解于AOT等离子型表面活性剂的反胶束相的主要推动力是表面活性剂与蛋白质的静电相互作用。此外，反胶束与生物分子之间的空间相互作用和疏水性相互作用对生物分子的溶解率(萃取率)也有重要影响。为增加反胶束萃取的选择性，带有亲和配体的助表面活性剂可以通过亲和作用协同反胶束萃取产品。蛋白质在反胶束内的溶解作用，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关。所以，任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，均有助于蛋白质的萃取。影响反胶束萃取生物分子的主要因素有水相的pH值、水相的离子强度、表面活性剂的种类和浓度、助表面活性剂、蛋白质的性质和浓度、有机溶剂的种类和温度等因素。
Kinugasa等人研究了水相离子种类对蛋白质萃取到反胶团溶液中的影响，使用碱金属和碱土金属离子对阳离子对蛋白质萃取到AOT/Isooctane反胶团溶液中的影响进行了考察。阳离子很大的影响了蛋白质的萃取速率，影响大小的顺序在单价离子中为K+ Yang等人用反胶束萃取从猪血浆中分离纯化γ—球蛋白。实验结果表明水相的pH值和盐(NaCl)浓度和有机相表面活性剂(AOT)的浓度是影响萃取Y—球蛋白的最重要的因素。在400mmol／L NaCl，350mmol／LA()T和pH＝7.0时，保证产物纯度为85％的条件下，可获得97％的收获率。[6] Cardoso, M.M.的研究还记录了苯基丙氨酸在TOMAC/hexanol/n-heptane反胶束体系中使用纤维模组的萃取时萃取过程中随着不同的水力状况苯基丙氨酸随时间富集的演变。[7] 4.2.3 应用 4. 2．3．1 蛋白质及酶的分离 Soni, Krishnakant在有机溶剂中利用反胶束萃取体系对发酵肉汤中的胞外酸性磷酸酶进行了萃取。使用200mM AOT/异辛烷在25C将过程参数优化至最大萃取率。酸性磷酸酶的萃取受PH值，离子强度，表面活性剂浓度和水相/有机相体积速率的影响。在PH8.0 50mM KCl时得到了75%的酶转移活性的最大值。通过使用3：1水相/有机相的体积比率萃取和1：1的水相/有机相的体积比率进行最优化的反萃得到了酸性磷酸29%的最大收率。对所有参数进行最优化后，通过萃取和反萃从最初的发酵肉汤里得到高达29%的1.28特殊活性的酸性磷酸酶收率。发酵液中的蛋白质浓度是比较高的，这影响了传递过程。这可以通过改变产酶发酵介质的组成来克服。反胶束萃取提供了选择性溶解蛋白质的体系并且这些数据还暗示了溶解是通过带电蛋白质和利用系统的离子强度PH值和水相/有机相比率处理过的胶束内层之间的静电相互作用力来控制的。[8] Alves, J.R.S.等人研究了利用反胶束萃取青霉素酰基转移酶的最优化。青霉素酰基转移酶被成功的从粗提物中通过渗透冲击萃取到了AOT/异辛烷反胶束相中,并通过简单的盐浓度的改变(1M/L KCl)反萃出了几乎纯的水相产物。该研究描述了ph值，离子 18 强度和表面活性剂浓度对酶从两相直接接触的水相到有机相传递过程的影响。最好的结果在两相接触三分钟后获得(with an agitation of 100 rpm), 0.10 mol l.1 NaCl, pH 5.5 a和 0.05 mol l.1 AOT。在该状况下描述了平衡分配，对应于60%的酶活传递酶的失活减少至不到10%。NaCl的浓度被证明是一个关键因素，从其浓度增加至0.125 mol/l使得萃取活性只有负载能力的10%。萃取最优化的pH处于一个比较小的间隔内(5.5 ± 0.5)。因该值是低于酶的等电点的，故传递过程受控于酶表面活性剂静电相互作用。AOT0.05 mol/l的浓度是在萃取收率和界面酶沉淀之间确定的一个折衷值。[9] Yan等利用一种新的表面活性剂大豆卵磷脂形成的反胶束体系，在引入亲和性配基后．成功地将溶菌酶、细胞色素c、清蛋白酶的混合物分离开来。由于配基具有极高的亲和专一性，大大提高了萃取率和纯化因子。[10] Sun等将CB—卵磷脂形成的反胶束溶液吸附于微孔聚丙烯中空纤维膜上，作为固定相，这种用色谱法分离蛋白质的方法称为中空纤维亲和色谱分离法(ho1Iow—fiber affinity partitioning chromatography，HFAPC)完全分离了牛血清蛋白(BSA)和溶菌酶。[11] 4.2.3. 2 氨基酸的分离 翁连进等研究了以二(2—乙基己基)磷酸铵表面活性剂在磺化煤油中形成的反胶束对碱性氨基酸的萃取，分别测定了该反胶束萃取氯化铵浓度为1、5，2．5，3．5和4．5moI／L的水溶液中的碱性氨基酸的分配系数，结果表明该反胶束具有优良的萃取性能，可从无机盐浓度更高的氨基酸水溶液中萃取出氨基酸。此外还对pH值及氯化铵浓度对萃取的影响进行了讨论。[12] 4.2.3.3抗生素的分离 国内外关于反胶束应用在抗生素提纯的报道很少，李夏兰等以AOT/异辛烷反胶束系统提取乳糖酸红霉素为例，探讨了反胶束萃取抗生素的可能性。在室温240C、PH5.0，NaCl浓度为0.2mol/L，用异辛烷作萃取剂直接萃取红霉素时，萃取效率只有5.12％左右，而加入AOT 0.05mol/L后萃取效率为94.4％，有显著增大，证明AOT/异辛烷系统萃取时不仅仅是异辛烷作萃取剂的有机溶剂萃取。将反胶束萃取剂循环使用3次，其萃取效率都在87％以上。萃取率变化都保持在较高水平，所以反胶束萃取剂能够循环使用。[13] Su等人将亲和配体胆兹醇D—丙氨酰D—丙氨酸酯固定于AOT／异辛烷反胶束溶液中，对万古霉素(pI＝8．1)的分离条件进行研究。结果发现，万古霉素可以在AOT反胶束中通过静电相互作用被萃取。在低于万古霉素pI值的pH范围内，在较低的pH和盐浓度的条件下可以增加其萃取效率。另外，当pH大于pI时反胶束萃取率相应增加。此外，万古霉素与胆舀醇D—丙氨酰—D—丙氨酸酯亲和作用，也可以增加萃取能力和分离效率。有亲和配体存在时万古霉素的萃取率从37％上升到80％，而反胶束萃取率保持不变，仍为95％。[16] 4. 2．4展望 反胶团技术的研究仅仅二三十年，该技术在分离和纯化生物物质方面就有处理量大、可连续操作和活性损失低等特点。亲和配体的引入提高了目标物的萃取率及分离的选择性，以及近年来它与其他应用技术的结合等方面都显示了较大的应用潜力。许多研究工作已充分说明了反胶束萃取法分离、提取蛋白质的可行性和优越性；不仅是蛋白质和酶能够被提取，核酸、氨基酸和多肽也可以顺利地溶于反胶团中。 但对反胶团体系的应用现在仅仅停留在研究阶段，至今仍无大规模的工业化应用，还存在许多技术上的问题有待解决。可以相信随着研究的深入反胶团萃取技术极有可能成为蛋白质等生物活性物质分离、提取的一种重要方法。 19 参考文献: [1] [2] 严希康 《生化分离技术》 华东理工大学出版社，1996：39-48 [3] [4] [5] Kinugasa, Takumi; Kondo, Aki; Mouri, Emiko; Ichikawa, Sakiko; Nakagawa, Satomi; Nishii, Yasuhiro; et. al. Effects of ion species in aqueous phase on protein extraction into reversed micellar solution .Separation and Purification Technology .Volume: 31, Issue: 3, June 1, 2003, pp. 251 - 259 [6] Yang T H，Yet M G，Hsu C K et a1．Journal of Bioscience and Bioengineering， 2001，92(3)：214-220 [7] Cardoso, M.M.; Viegas, R.M.C.; Crespo, J.P.S.G. Extraction and re-extraction of phenylalanine by cationic reversed micelles in hollow fibre contactors . Journal of Membrane Science Volume: 156, Issue: 2, April 30, 1999, pp. 303-319 [8]Soni, Krishnakant; Madamwar, Datta . Reversed micellar extraction of an extracellular acid phosphatase from fermentation broth Process Biochemistry Volume: 36, Issue: 4, November, 2000, pp. 311 – 315 [9] Alves, J.R.S.; Fonseca, L.P.; Ramalho, M.T.; Cabral, J.M.S. Optimisation of penicillin acylase extraction by AOT/isooctane reversed micellar systems Biochemical Engineering Journal Volume: 15, Issue: 2, August, 2003, pp. 81-86 [10] Yan.s;lehikawa.s;Sugiura.s and Furusaki.s. Biotechnol Bioeng.1998,58(1):58~64 [11] Sun Y，Shi Q．Separation Science and Technology，1999，34(16)：3255—3266 [12] 翁连进，王士斌等《二[2—乙基己基]磷酸铵反胶束萃取碱性氨基酸的研究》昆明 理工大学学报 第25卷 第1期 2000年2月 pp：129-132 [13] 李夏兰，翁连进，陈培钦 反胶束萃取乳糖酸红霉素的探讨 药物生物技术 2003， 10(1)：29-32 [14] Su W D，Lee C K．Separation Science and Technology，1999，34(8)：1703 —1715 4.3、凝胶萃取 4.3．1凝胶萃取过程简介 凝胶萃取过程是Cluster[1]在1984年在美国最先提出的一种新型分离技术。凝胶萃取的原理可用下图表示：首先凝胶与溶液接触，吸收其中的溶剂而溶胀，溶质则受凝胶网络的排斥，在溶液相得以浓缩；将浓缩液与凝胶分离后略改变凝胶的环境温度[14]或酸度使其释放出大部分吸收的溶剂；最后将凝胶与释放液分离，凝胶可重复使用。某些凝 20 百度搜索“77cn”或“免费范文网”即可找到本站免费阅读全部范文。收藏本站方便下次阅读，免费范文网，提供经典小说综合文库第四章 生物产品萃取技术(4)在线全文阅读。
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