第四章 生物产品萃取技术(2)

解度很大，表观分配系数增加，这时，分配系数与蛋白质的浓度有关。盐的浓度（离子强度）不仅影响蛋白质的表面疏水性，还会改变两相中成相物质的组成和相体积比。不同的蛋白质受离子强度的影响程度不同，因此，调节系统中盐的浓度，可以有效地萃取分离不同的蛋白质。

4.1.2.3 pH值

pH值会影响蛋白质的解离度，改变蛋白质的表面电荷数，从而改变分配系数。此外，pH值还会影响系统中缓冲物质磷酸盐的解离程度，使H2PO4-和HPO42-之间的比例改变，影响相间电位差，从而影响分配系数。对某些蛋白质，pH值的微小变化会使分配系数改变2到3个数量级。理论上，在相间电位为零的双水相系统中，蛋白质的分配系数不受pH值的影响，而实际上对于许多的蛋白质而言，相间电位为零时的分配系数会随着pH值的变化而增减，这表明，蛋白质的结构和性质（如疏水性）会随pH值的变化而改变。

4.1.2.4 温度

温度影响相图，同时影响分配系数和蛋白质的活性。一般在临界点附近，温度对分配系数的影响比较大，远离临界点时，影响较小。1～2℃的温度变化不会影响萃取分离的效果。

一般而言，大规模的双水相萃取操作不需要冷却，在室温下即可进行。这样可以节约操作成本。此外，由于PEG对蛋白质有稳定作用，因此常温下蛋白质不会失活变性；而且，相对于冷却状态下而言，常温下液体粘度较低，相分离容易进行。

4.1.2.5 细胞

细胞破碎的程度以及细胞壁和细胞膜不同的化学结构会导致双水相体系上下相比例的改变，影响蛋白质的分配系数，K. pneumoniae在细胞浓度大于3%时，双水相体系中上下相体积的比例基本不变，但是随着细胞浓度的增加，细胞破碎后释放的内含物的分配系数会迅速下降[4]。

4.1.3 双水相萃取的应用

4.1.3.1酶的分离提取

双水相萃取技术目前较多的应用于胞内酶的提取和精制上。胞内酶提取的第一步是

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细胞破碎，所得到的细胞匀浆液粘度很大，而且存在微小的细胞碎片。除去细胞碎片的传统方法是离心分离，但是该方法能耗大，并且细胞碎片不易完全去除。和传统的细胞碎片的分离方法（如过滤和离心法）相比，双水相体系具有一定的优点：双水相萃取具有较高的处理容量，时空产量及酶的回收率。一般来说，传统的处理方法达到相同的处理量时，需要比双水相萃取多3到10倍的设备。双水相萃取和其他分离方法的比较如表3－2所示[4]。

表3－2不同方法除去细胞碎片时性能数据的比较

方法 双水相萃取碟式离心机 连续分离 碟式离心机 间歇离心 ∑：7000 m2 转鼓式过滤器 A：1.5 m2 中空纤维错流过滤 A：10 m2(a) 20 m2(b) 细胞量 Kg 100 体积 L 330 浓度 Kg/l 0.3 处理量 时空产量l/h Kg/l·h 120 0.11 收率 % 90 浓缩倍数 3-5 时间 h 3 成本 $ 7.800 100 1000 0.1 100 0.01 85 1 10 30.000 100 500 0.2 60 0.02 85 1 8.3 46.000 100 100 200 400 0.05 0.03 200 400 0.005 0.003 85 85 1 10 10 25.000 40.000 注：表3－2中，(a) 酶滞留比R＝0；（b）酶滞留比R＝0.7

和传统的酶粗提方法（如盐析和沉淀法）相比，双水相萃取也具有一定的优越性。表3－3为在β－半乳糖苷酶纯化过程中，沉淀法及双水相萃取法的比较。结果表明，双水相萃取不但具有处理容量大，步骤少的优点，而且收率及纯化倍数均高于沉淀法。

表3－3 β－半乳糖苷酶纯化方法

比较（根据总面积为734 m2的碟式离心机间歇离心的数据计算）

方法 沉淀法 双水相萃取法 步骤数 3 1 流量（Kg/h） 0.77 10-15 酶收率(%) 63 77 纯化倍数 3.5 12.8 总纯度(%) 23 43 双水相萃取分离酶的例子非常之多。例如，Kula等人[5]采用PEG/盐（Salt）体系，用于除去胞内酶的细胞碎片及其他杂质如杂蛋白、核酸和多糖等。有关应用见表3－4。由表3－4可以看出，大多数酶的分配系数在3到20之间，一步萃取不但可以除去细胞

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碎片，而且约有50～80%的杂蛋白也可同时除去，酶的收率为85～98%。双水相萃取应用到酶的纯化工艺时，一般应用一级或多级错流萃取。图3－2为二级萃取的实例。 表3－4 双水相萃取法从细胞破碎液中提取和纯化酶

酶 α－葡萄糖苷酶 乙醇脱氢酶 己糖激酶 葡萄糖异构酶 支链淀粉酶 磷酸化酶 异亮氨酰－TRNA合成酶 延胡羧酸脱氢酶 天门冬氨酸酶 β－半乳糖苷酶 亮氨酸脱氢酶 乳酸脱氢酶 L－2－羟异己酸脱氢酶 亮氨酸脱氢酶 甲醛脱氢酶 甲酸脱氢酶 异丙醇脱氢酶 细胞来源 Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Streptomyces species Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae E．Coli E．Coli E．Coli E．Coli Bacillus spaerious lactibacillus species lactobacillus confusus Bacillus cereus Candida boidinii Candida boidinii Candida boidinii 成相体系 PEG／Salt PEG／Salt PEG／Salt PEG／Salt PEG／dextran PEG／dextran PEG／Salt PEG／Salt PEG／Salt PEG／Salt PEG／crude dextran PEG／Salt PEG／Salt PEG／Salt PEG／crude dextran PEG／crude dextran PEG／Salt 分配系数 2.5 8.2 3.0 3.0 1.4 3.6 3.2 5.7 62 9.5 4.8 6.5 20 11 7.0 19 收率 95% 96% 92% 86% 91% 85% 93% 93% 96% 87% 98% 95% 93% 98% 94% 91% 98% 纯化倍数 3.2 2.5 1.6 2.5 2 1 2.3 3.4 6.6 9.3 2.4 1.5 17 1.3 --- --- 2.6

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图3－2 连续错流萃取纯化酶的工艺流程图

当相界面不含有分配物时，某种蛋白在上相中的收率Y可用下式表示：

100 （3－4） Y＝ （%）1＋（VB /VT） （ 1/KE） 由（3－4）式可知，酶收率主要取决于下相与上相的体积之比，即相比（VB/VT）和分配系数KE，而与成相总体积无关。

4.1.3.2其他应用

4.1.3.2.1萃取细胞、细胞器、膜等粒子

萃取细胞、细胞器、膜等粒子的主要目的有分离提纯、分级分离、探测体内反应或体外处理时颗粒表面的变化、研究颗粒表面结构与生物学功能的相互关系、研究细胞与细胞或细胞与生物大分子间相互作用以及探测种属关系十分接近的细胞表面细微的差别。萃取的产品如表3—5所示。

表3—5 双水相萃取细胞、细胞器、膜的种类

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4.1.3.2.2生物活性物质的分析检测

双水相萃取分析技术已经成功的应用于免疫分析和细胞数的测定。在该方法分析生物分子的过程中，一般需要一种与待测分子定量复合的物质。只要复合物和反应物之一在双水相体系中的分配系数不同，尤其是分配在不同的相中，就能进行分析。例如，可以用双水相萃取技术对黄毒苷进行免疫测定。具体方法是用I125标记的黄毒苷与含有黄毒苷的血清样品混合，再加入一定量的抗体，反应后加入双水相使其分相，抗体分配在下相，黄毒苷在上相，利用分配系数的不同，通过测定上相的放射性就可以测定免疫效果。

4.1.4 双水相萃取技术的新进展

4.1.4.1 新型双水相体系的开发

新型双水相体系主要有两类：廉价高聚物/高聚物体系及新型功能双水相体系[5]。常用的双水相体系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran)体系和PEG/磷酸盐体系。成相聚合物价格昂贵是阻碍该技术应用于工业生产的主要因素。葡聚糖是医疗上的血浆代用品，价格很高，用粗品代替精制品又会造成葡聚糖相粘度太高，使分离难于进行。研究应用最多的PEG并不是双水相体系最适合的聚合物，而磷酸盐又会带来环境问题[8]，而且因为体系中盐浓度高，无法实现亲和分配，并会破坏某些生物物质的活性，而使其应用范围受到限制。目前用作成相的聚合物或盐类还很少，缺乏价格低廉、性能好且无毒的聚合物或盐。因此开发新型的双水相体系是该技术应用中急需解决的问题。

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