第四章 生物产品萃取技术(3)

4.1.4.2 廉价双水相体系

双水相萃取与传统方法相比有许多优点，具有技术可行性，但实用性如何还取决于其经济可行性。随着生产规模的加大，双水相萃取所耗的原料也成比增加，由于其原料成本占总成本的90%且高于一般的离心沉淀法，因此，规模加大之后，技术优势就逐渐减小。此外，生产的总成本除取决于操作费用之外，还取决于设备的投资费用。虽然传统的分离方法所需的设备投资比双水相萃取法大3～10倍，但随着批处理次数的增加，设备投资成本所占的比例将减小。所以，由于原料成本较高，当生产规模很大时，双水相萃取法在生产成本上并无太大的优势，因此，降低原料成本是发挥其技术优势的一个方向，这就使廉价双水相体系的开发成为必要。

廉价双水相体系的开发目前主要集中在寻找一些廉价的高聚物来取代现用的昂贵高聚物。Krone（1981年）首先利用粗dextran取代dextran，Folke（1987年）用变性淀粉PPT取代dextran，Skuse（1992年）利用羟基纤维素取代PEG，都获得了一定的成功。目前已开发了几种成本较低的聚合物来代替葡聚糖。例如，牌号PPT的变性淀粉、牌号为RcPPa/PES的淀粉衍生物以及牌号为Pulluan的微生物多糖等。利用PPT代替dextran的亲和双水相已用于大规模地从肌肉中提取乳酸脱氢酶，回收率可达96%，从而使该工艺过程更为经济可行[7]。谭天伟等[7]人系统地研究了十几种水溶性高聚物的相图，结果表明，PEG/ReppalPES体系成本较低，只有PEG/dextran体系成本的1/8，因而有可能取代PEG/dextran体系，还利用PEG/ReppalPES体系从黄豆中分离纯化了磷酸甘油酸激酶（PGK）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。另外，葡聚糖还可以被糊精、麦芽糖糊精和乙基羟乙基纤维素（EHEC）等物质取代。聚乙烯醇（PVA）或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）目前已作为PEG的替代品用于双水相萃取，而磷酸盐已被硫酸钠、硫酸镁和碳酸钾等所取代[8]。

4.1.4.2 新型功能双水相体系

新型功能双水相体系是指高聚物易于回收或操作简便的双水相体系。Alred采用乙烯基氧与丙烯基氧的共聚物和PEG形成温敏性双水相体系。Kula等人开发了一种表面活性剂和水形成的温敏性双水相体系。在双水相萃取技术的研究过程中，不断有新体系被开发出来，如双水相胶束体系，它更适合于分离纯化生物分子，并且易于放大，便于生产，组成更加简单、操作更加灵活，提取更加便捷。此外，还开发出由去污剂形成的双水相体系。最近，利用温度诱导相分离，实现聚合物的循环利用引起了学术界的普遍关注。

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环氧乙烷（EO）和环氧丙烷（PO）的无规则共聚物是通过热力学平衡进行分离的。当温度高于临界点时分成两相，形成几乎是纯水的上相和富集聚合物的下相（通常含EOPO40 %～60 %，即水-EOPO相）。利用这一点，可以对被萃取物进行分离纯化，并能实现聚合物的回收和利用。

阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）和阳离子表面活性剂溴化十二烷基三乙铵（C12NE）的混合体系，在一定浓度和混合比范围内、无任何外加物质的条件下，可以形成互不相溶、平衡共存的两相，两相均为很稀的表面活性剂水溶液（其总质量浓度在1%以下），称为表面活性剂双水相体系。这是双水相分离技术的一个新的分支，其中阳离子表面活性剂过量的双水相体系，称为阳离子双水相。这些新体系不仅操作成本低、萃取效果好，还为活性物质提供了更温和的环境[10]。将这种双水相系统应用于牛血清蛋白和牛胰蛋白酶的萃取中，已初步显示了其用于生物大分子萃取分离的优越性[11]。

非离子表面活性剂双水相萃取分离法适合于分离具有一定硫水特性的水溶性蛋白质。该系统属于温度依赖型的双水相体系。当温度高于某点（浊点）时，包含蛋白质的表面活性剂就会从水相中分离出来，同时，水相中还留有少量的表面活性剂和蛋白质。与其他的双水相体系相比，在表面活性剂的浓度很低（1%w/w左右）时就会产生相分离，而且不需要有机溶剂。Tritonx-114是一种常用的表面活性剂，它的浊点低，不会使蛋白质变性，而且分离细胞膜蛋白质的效率也比较高。

在新型双水相体系的开发中，今后研究的焦点应该是进一步认识双水相萃取的基础理论，寻找更为廉价的成相物质，以提高萃取专一性。

4.1.4.3 双水相萃取与细胞破碎过程相结合

在高速珠磨机内，将细胞破碎和双水相萃取过程结合，同时进行。由于珠磨机内具有良好的混合条件，使PEG、无机盐和水能够得到充分混合，形成均匀的双水相分散体系。细胞破碎释放出的产物很快被萃取到PEG富集相。经过珠磨机加工的匀浆直接用离心机分相，离心之后，细胞碎片分配在下相，胞内产物分配上相。这种方法不仅节省了萃取的设备和时间，而且由于双水相可以保持很多蛋白质的活性，因此，能避免胞内产物的额外损失[12]。

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4.1.4.3 耦合双水相萃取技术

4.1.4.3.1 亲和双水相萃取

近年来，为了提高双水相萃取的专一性，借鉴亲和层析的优点，发展了一种亲和双水相分配技术，该技术对成相聚合物进行修饰，即将亲和配基（如离子交换基团、疏水基团、染料配基，金属螯合物配基以及生物亲和配基等）通过化学交联或分配的方法结合到成相聚合物上，有选择性地将某种蛋白萃入该相中，而杂蛋白仍旧留在另一相中。亲和双水相不仅具有萃取系统处理量大，放大简单等优点，而且具有亲和吸附专一性强，分离效率高的特点。目前，利用亲和双水相萃取技术已成功地实现了β－干扰素，甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶等多种生物制品的大规模提取[12]。表3－6列出了一些应用亲和双水相分离纯化蛋白质的实例。

表3－6 亲和双水相分配应用于蛋白质纯化的例子 纯化的蛋白质 β－干扰素 延胡索酸脱氢酶 葡萄糖－6－磷酸化脱氢酶 己糖激酶 L－乳酸脱氢酶 D-hydroxy isocaproate dehydrogenase 羟基异己酸酯脱氢酶 磷脂酸 Procion Red HE-3B Procion Yellow HE-3G Cibacron blue F3G-A Prodon Yellow HE-3G Cu2+ 亲和配基 其中，直接从细胞碎片中纯化延胡索酸脱氢酶及乳酸脱氢酶已达到中试规模。 亲和分配与亲和层析相比，具有以下优点：亲和分配可以直接处理发酵液及细胞破碎液；亲和层析中的传质一般为扩散过程，而亲和分配一般是流体对流传质控制，因而传质阻力要小得多，传质速度比亲和层析快；亲和分配具有较高的处理容量，也易于放大。

4.1.4.3.2 双水相萃取与膜分离相结合

利用中空纤维膜传质面积大的特点，将膜分离与双水相萃取相结合，可以大大加快萃取传质的速率。而且，利用膜将双水相体系隔开，还可以避免由于双水相体系的界面张力小而产生的乳化作用以及生物大分子在两相界面的吸附。因此，将膜分离同双水相萃取技术相结合，是解决双水相体系易乳化问题及加快萃取速率的有效手段。

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4.1.4.3.3 双水相萃取与电泳技术相结合

近几年来，随着生物技术的迅速发展，制备型电泳技术的研究受到了广泛的重视。双水相电泳是传统的溶解技术与电泳的结合，是一种新型的分离技术。由于双水相具有生物相容性，所以，双水相电泳技术为生物分子的成功分离提供了很好的方法。利用葡聚糖－聚乙烯与乙二醇－水系统分离氨基酸，在间歇设备中对影响分离因素，如分离时间、浓度、初始溶解浓度和相界面作用力等进行了研究。实验结果表明，在氨基酸的分离中，双水相电泳是一种高效的分离技术[14]。

4.1.4.3.4 与生物转化过程相结合

在生物转化过程中，转化产物量的增加，常会抑制系列化过程的进行。因此，及时移走产物是生化反应中的主要问题之一。如果酶催化的生物转化过程和微生物发酵过程在双水相萃取系统中的某一相中进行，而产物能够分配于另一相中，则可避免产物对生物转化过程的抑制，又可以减轻目标产物与反应物及生物体或酶混于一体难以分离的困难。Andersson等曾综述了双水相萃取系统中进行的生物转化过程（包括酶催化和微生物发酵）。其研究结果表明，在双水相萃取系统中进行的生物转化，其生产能力、收率及分离效率均优于单一水相中的结果。

生物转化[15]

随着生物技术的不断发展，双水相萃取体系必将不断完善。开发新型的萃取体系、优化萃取工艺，研究体系的分相技术、萃取设备以及基础理论可改进双水相萃取技术，使其实用化，并在生物物质的分离中发挥独特的优点。

参考文献

[1]. Albertsson P.A. ,Partition of Cell Particles and Macromolecules(1960), John Wiley New York. [2]

[3] 毛贵中主编. 生物工业下游技术. 中国轻工业出版社. 1999.

[4] K.H. Krone et al. Extraction enzyme recovery：economical consideration. Process Biochemistry, 1984,19: 170~176.

[5] Kula et al. Purification of enzymes by liquid-liquid extraction. Advances in Biochemical

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Engineering, 1982, 1(24): 73-118.

[6] 谭天伟，沈忠耀. 双水相分离技术的评价与展望. 微生物学通报. 1996, 23(6) : 368-372.

[7] 吕斌等.双水相萃取技术及其在生物、食品工业中的应用.食品与发酵工业,2001,27(6):70-74.

[8]. 陆强等. 提取与分离天然产物中有效成分的新方法--双水相萃取技术.中成药,2000,22(9):655-659.

[9] 谭天伟,沈忠耀. 用双水相萃取分离纯化磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶生物工程学报12(增刊),1996:168-170.

[10] 张珩等. 双水相萃取技术应用在医药工业中的展望.医药工程设计杂志,2001,2(25):23.

[11].童爱军等. 阴阳粒子型表面活性剂双水相萃取色氨酸衍生物和牛血清白蛋白.分析化学,1998,26(5):535-539.

[12].Su Zhi-Guo. Feng xiao-li. Process integration of cell disruption and aqueous two-phase extraction. Journal of chemical and biotechnology,1999,74(3):284-290.

[13].姜伟等. 微生物胞内产物分离的新方法-双水相萃取技术. 工业微生物，1994,24(1):35-36.

[14] S.L.Zhai,G.S.Luo and J.G.Liu. Aqueous two-phase electrophoresis for separation of amino acids.Separation and Purification Technology,2001,21(3):197-201. [15]

4.2 反胶团萃取

随着基因工程和细胞工程的发展，传统的溶剂萃取技术难以应用于蛋白质的提取和分离。有两个主要原因：一是被分离对象——蛋白质等在40-50℃便不稳定，开始变性，而且绝大多数的蛋白质都不溶于有机溶剂，若使蛋白质与有机溶剂接触，也会引起蛋白质的变性；二是萃取剂问题，蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取剂很难奏效。而新型萃取技术反胶团（Reverse Micelle）萃取有可能解决外源蛋白的降解，且可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。

4.2.1 原理

表面活性剂是由亲水的极性头和疏水的非极性尾两部分组成的。当表面活性剂在溶剂中的浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂就聚集，形成胶团。在有机溶剂中形成极性头向内，非极性尾朝外的含有水分子内核的聚集体，即反胶团。

极性核溶入水后形成“水池”，当反胶团相与含有蛋白质的水相混合，蛋白质能增

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