细胞模型建立的指导原则和标准操作规范第一版 - 图文(9)

的准确性。滴加第二个计数池细胞悬液时应该再次混匀滴加。

[5] 镜下计数时，2个以上细胞组成的细胞团应按单个细胞计数，如细胞团占10%以上，表面细胞分散不充分，将影响细胞计数的准确性。应该分散处理后，重新计数。

[6]如果细胞很少，要计数一个或更多个计数池内的小方格细胞（每一方个为1mm2），如果细胞数过多，仅计数1mm2对角线的5个小方格（每个小方格200×200μm）的细胞。 [7] 100×放大倍数下计数细胞。 附件6.细胞群体倍增时间的测定 生长曲线测定 1.计数法

实验原理：生长曲线的测定（计数法）是测定细胞绝对生长数量的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，为培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后经过长短不同的潜伏期，即进入细胞大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平台期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数，通常计数7天。为精确起见，一般每次计数三瓶细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期、快速生长期、平台状的平台期及退化衰亡四个部分。以存活细胞数对培养时间做图，即生长曲线。 （1）取生长良好的细胞，吹起混匀后计数。

（2）根据细胞计数结果，按下表在25cm2培养瓶中接种。 分组 接种密度 5×104/ml10üS-1640 细胞悬液的（ml） 时间点（h） 量（ml） 5×104/ml 1 9 24,48,72，96，120，144，168 1×105/ml 2 2×105/ml 4 4×105/ml 8 8 6 2 24,48,72，96，120，144，168 24,48,72，96，120，144，168 24,48,72，96，120，144，168 1 2 3 4 36

（3）24 h后开始计数细胞，以后每24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7 d。

（4）根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

要做好生长曲线（计数法）的实验，我们必须注意以下的要点。首先，要保证每一瓶中细胞的数量是一致的。这要求在我们接种细胞时就必须准确，否则实验会有很大误差。其次，每天计数时，要将细胞完全从瓶壁上吹下。取走细胞后，我们还可以用显微镜镜检培养瓶。再次，细胞计数时要共计数2块计数板，即4个格子，以减少误差。事实上，我们发现两块计数板之间还是有很大误差的。计数时，每一个中格的细胞数最好在10～50个之间。 2.MTT法

MTT还原实验的原理：MTT（四甲基氮唑蓝）为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下生成蓝紫色的甲瓉结晶，结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。用DMSO来溶解还原产物，利用酶标仪测定560 nm处的光密度A值，以反映出活细胞数目。 实验物品准备： （1）无菌物品

96孔板，24孔板，培养瓶（照射灭菌）

50ml离心管（γ射线辐照灭菌）、10 ml 移液管 、弯滴管 、24孔板盖 、200μl枪头（排枪用） （加MTT的可以反复打开用3次）、200μl枪头 青霉素瓶

（2）普通（不需要灭菌的）：200ul 枪头（排枪用）1盒、平皿、EP管 （3）无菌的试剂：RPMI-1640培养液、小牛血清、1×PBS、0.25%胰酶、MTT储存液（5mg/ml）

（4）其他试剂：0.4%台盼蓝染液、DMSO、 （5）试剂配制备： ①10×PBS配制： 7.0 g NaCl 0.272 g KH2PO4

1.392 g K2HPO4 ( 或K2HPO4.3H2O 18.23g)

K2HPO4的分子量为174.2，而K2HPO4.3H2O的分子量为228.22 用100ml去离子水溶解。 混匀后，分装，-20℃冻存。

使用前，解冻储存液，1:10 稀释为1×PBS工作液 ② MTT(5mg/ml 溶解于PBS)

200mg MTT, 加 40 ml PBS 0.22μm微孔率膜过滤后-20 ℃,避光保存。

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使用前，用无菌的 PBS稀释为2mg/ml

本室所用MTT为Sigma产品，淡黄色粉末，需要在4℃避光保存。

③ DMSO：除进口产品（Sigma）外, 国产优质分析纯（ 滤板过滤后）或色谱级DMSO也可以用于 MTT还原实验，但不同产品有差异，一段时间内的实验最好用同一产品。DMSO在室温避光存放。 ④灭菌的PBS

PBS分装于500 ml盐水瓶中，盖反帽塞和纱布，斜插入针头，高压锅内，121℃高压30 分钟，灭菌，压力降下后，打开锅，取下针头。冷到室温，放4℃冰箱中存放。

⑤RPMI 1640配制方法（医学实验科配制方法，也见附件12.5） 准备：去离子水10000ml，盛装于2个5000ml 三角烧瓶中 烧杯：5000ml(2个)，2000ml(1个)，量筒：1000ml(1个) 试剂：1640干粉，NaHCO3，HEPES，浓HCl 磁力搅拌棒，滴管。

配制：向烧杯中加入2000ml（所要配制试剂总量的5%）去离子水。将1640干粉倒入其中，室温轻轻搅拌。以去离子水冲洗塑料袋内剩余培养基干粉。每升培养液各加入2.0g NaHCO3和2.0gHEPES。以去离子水稀释至10000ml刻度，轻轻搅拌，待完全溶解后，以浓HCl调节pH值至7.3（在酸度计处调节pH）。

无菌抽滤后，分装保存于-20℃。

（6）取对数生长期细胞，离心收集细胞，根据计数结果调整细胞悬液密度为105～106个/mL，由细胞群体倍增时间确定接种密度。按100μl/孔（1×104～105个细胞）接种于96孔培养板内，每组细胞接种6个孔（至少3个孔），取平均值，切记各孔的接种密度一致。 （7）置37℃、5％CO2、和饱和湿度条件下培养。

（8）用PBS配制5mg/ml的MTT溶液，0.22微膜过滤除菌，4℃避光保存。

(配好的溶剂有效期两周，过期的不能再用于实验，须重配。)

（9）从第24h开始，每24h随机取1块96孔板（连续7天），96孔板每

孔加入20μl 5mg/ml MTT液，继续培养4 h后，离心后甩弃出孔内培养液；向每孔加入150μl DMSO，置于5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养5分钟。

（10）酶联免疫检测仪检测各孔OD值，检测波长570 nm, 以时间为横坐标， 平均OD值为纵坐标，记录并绘制细胞生长曲线。 （11）确定细胞的群体倍增时间 将处于对数生长期的细胞，按4×104/ml，0.5 ml每孔接种于24孔培养板，设3个复孔以上，培养48h。计数每孔细胞数，每孔计数2次，取均值。按下面公式计算群体倍增时间（TD）。

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式中 t 代表培养时间，N0和N1分别代表接种时和培养t小时后的细胞数。 注：

1.选择适当的细胞接种浓度。因此，在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。

2.细胞生长曲线96孔板方法，由于每孔太小,接种细胞数量要很精准，要注意生长7天时每孔细胞生长的密度。

3.避免血清干扰，在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

4.MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

5. MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成 5mg/ml保存在-20℃长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包裹以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

6. MTT有致癌性，用的时候小心,实验时戴上簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；向96孔板加MTT时不避光也没有关系，其时间较短，也可以把操作台上的照明灯关掉，再加入MTT。 7．同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜） 附件7.微量加样器（移液器）的具体操作方法 (一) 设定容量值

Pipetman P加样器容量计读数由三位数字组成(显示所转移液体容量)，读数精确到个位数。Eppendorf Research加样器容量计读数则由四位数字组成，读数精确到小数后一位，从上(最大有效数字)到下(最小有效数字)读取。利用底部刻度可将容量调节到更精确的分度。Pipetman P根据型号不同，数字可能是黑色或红色的。Eppendorf Research加样器的数字不同型号均为白色。

转动加样器的黑色调节环或按钮的白色调节旋钮均可设定容量。用白色调节旋钮设定容量比较方便和快速，尤其是穿戴手套时。使用黑色调节环可较准确调节到设定值。 (二) 吸液

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首先选择一支合适的吸头安放在加样器套筒上。使用P5000及P10ML时，装吸头前必需在套筒上加插一过滤芯。稍加扭转压紧吸头使之与套筒间无空气间隙。未装吸头的加样器绝不可用来吸取任何液体。 标准吸液步骤如下：

1．把按钮压至第一停点。

2．垂直握持加样器，使吸头浸入液样中，浸入液体深度视型号而定。 3．缓慢、平稳地松开按钮，吸液样。等1s，然后将吸头提离液面。用药用

吸纸抹去吸嘴外面可能附着的液滴。小心勿触及吸头口。

(三)放液

1．将吸头口贴到容器内壁并保持100～400倾斜

2．平稳地把按钮压到第一停点。等1s后再把按钮压至第二停点以排出剩余液体。

3．压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过。 4．松开按钮。

5．按吸头弹射器除去吸头(只有改用不同液体时才需更换吸头)。 (四)预洗

当装上一个新吸头(或改变吸取的容量值)时应预洗吸头，先吸人1次液样并将之排回原容器中。

预洗新吸头能有效提高移液的精确度和重现性。这是因为第 一次吸取的液 体会在吸头内壁形成液膜，导致计量误差。而同一吸头在连续操作时液膜 相对保持不变，故第2次吸液时误差即可消除。 (五)致密及黏稠液体

对于密度低于水的液体，可将容量计的读数调到低于所需值来进行补偿。 例如：用P20移液器转移10／11血清。先将读数调到10／1，吸取后以重量法测定。如实测体积为9．5／1l，即偏差0．5／11，则将读数调到10．5Pl并重复1次。如第2次测定仍不够准确，根据偏差再作调整。排放致密或黏稠液体时，宜在第一停点多等1～2s再压到第二停点。对密度高、黏稠度大或挥发性的液体，推荐使用活塞正移动加样器。 (六)加样器吸头

加样器吸头是整个移液系统的有机组成部分，对其基本要求是，必须有高机械、热力学和化学稳定性，且纯度高，生产过程纯净，无有机或化学物质(如染料)和重金属污染。选择密封良好的环口、薄壁和嘴口尖细的吸头，将使得在加样时，吸头的安装或卸脱更加容易。吸头管壁有弹性，加样吸液时不会产生漩涡，这样加样的精度就更高。吸头嘴口无毛刺，表面光洁平滑，使得其沾湿性极小，可避免液体滞留外壁引起的误差。吸头应与加样器上吸头套筒密封完好，可防止由于空气泄漏 而造成加样精度或准确度的误差。此外，吸头还应有液体容积刻度线。D200吸头在20／1l和100~1处有标记；D1000吸头在300~1处有标记，D10吸头在2／A1处有标记。最

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