细胞模型建立的指导原则和标准操作规范第一版 - 图文(4)

得小于1公分高度）。

5.取出已经预热好的培养用液，用75%酒精纱布擦拭后方能放入超净台内。

6.从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精纱布擦拭显微镜的台面，再观察细胞。

7.将各瓶口一一打开，同时将瓶口在酒精灯火上或红外灭菌器灼烧消毒。

（二）观察

1.肉眼观察：培养基浅黄色，澄清透明，此时需要半换液或全换液。如果培养基为其它颜色则细胞生长不是很好（见附件13.（细胞生长状态及形态学特征观察）表7.2/2表注的描述）。

2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞的生长状态，细胞折光性好，细胞大小基本一致，细胞质均匀细腻，无粗大颗粒。细胞膜完整无固缩。细胞均匀分布或呈簇和较大团块（如葡萄样）悬浮生长，根据细胞来源及细胞株特点呈现均匀悬浮、呈簇悬浮和团块悬浮生长特性。

3.将细胞悬液用10ml刻度吸管转移至50ml锥形离心管中。 4. 离心1500转/分钟 离心5分钟 室温。

5.将上清倒入废液缸中，此步骤，不要甩弃动作，只做2～3秒钟的停留，翻转管，轻叩管底，使细胞松散，准确加入无血清RPMI-1640，用滴管轻轻吹打细胞制成单细胞悬液。取100μl左右体积的细胞悬液后，立即在加入的无血清培养基中添加小牛血清，使成10%小牛血清 RPMI-1640培养基重悬的细胞悬液。 （三）传代细胞：

1.取100μl左右体积的细胞悬液，行台盼蓝拒染计数。根据各细胞冻存，复苏和传代操作规程要求的传代密度传代细胞。如果现培养的细胞没有建立冻存，复苏和传代操作规程，其细胞传代密度可参考同源细胞株，如果没有来源相同的细胞株作参考，需要参考其他悬浮生长细胞的传代密度。同时需要注意该细胞 培养经验积累和数据记录，为撰写操作规程做好准备。

2.注意密度过小会影响传代细胞的生长。最后要做好标记。 3.用酒精纱布擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。 4.根据细胞的倍增时间和细胞生长密度以及培养基颜色综合考虑细胞的传代和扩增。没有细胞群体倍增时间数据的细胞株，到ATCC网站去查找，如果没有查到，就要本实验室验证细胞的群体倍增时间，详细操作（见附件6）。

三、细胞冻存

本方法适用于贴壁细胞、半贴壁细胞和悬浮生长的细胞，除贴壁细胞需要胰蛋白酶消化外，其他两种生长方式的细胞不需要消化。唯有半

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贴壁细胞需要弯头滴管轻轻吹打即可脱壁成单细胞悬液。 1.材料：

生长良好的细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数板与盖玻片。 2.冷冻保存方法：

（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟、-20℃30分钟、-80℃16～18小时(或隔夜)、立即放入液氮长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，存活率稍有降低。

（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温仪以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮内长期储存。适用于悬浮型细胞与杂交瘤保存。 3、步骤：

（1）冷冻前24～48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。

（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管， 加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。

（3）离心收集培养细胞，用加血清的培养基重悬细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全冷冻保存管中（1～2ml），并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项：

（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高状态，贴壁细胞约为80～90％融合率。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如杂交瘤应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体产生。

（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70℃可保存数月。

（3）注意冷冻保护剂的品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。如用甘油，亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。DMSO直接加入时释放的热量对细胞有损伤，应缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（4）冷冻保存细胞浓度：

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①正常人纤维母细胞:1～3×106个细胞/ml

②杂交瘤:1～3×106个细胞/ml，某些杂交瘤会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

③贴壁肿瘤细胞株:5～7×106/ml，依细胞种类而异。HeLa只需1～3×106个细胞/ml。

④悬浮生长细胞:5～10×106个细胞/ml，人淋巴细胞需至少5×106个细胞/ml。

（5）冷冻保护剂浓度为10％DMSO，若是不确定细胞冷冻条件，在做冷冻保存同时，亦应作一个备份培养，以防止冷冻失败。 （6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4℃时），复苏存活率在80%～90%以上。对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。 注：

1.冻存细胞要处于指数生长期；

2.严格按照冻存降温的顺序冻存外，放入液氮罐的分斗中要盖好分斗盖，防止冻存细胞掉入液氮液面中。

3.在冻存管外贴好标签（细胞株、冻存日期）外，在外包装上再贴一同样的标签，便于查找。

四.细胞的复苏

细胞复苏的原则既是快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。具体操作 方法1：

（1）将水浴锅预热至37℃

（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 （3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等。（4）戴好眼睛和手套，根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 （5）从液氮罐中取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

（6）迅速解冻： ①迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。②约1～2min后冻存管内液体完全溶解，取出用75%酒精纱布擦拭冻存管的外壁，移入超净台内操作。 ③可将融化的冻存细胞直接加入10ml10%小牛血清 1640培养基中，接种如25cm2培养瓶，置37℃ 5%CO2 饱和湿度培养，第二天，弃掉培养液，更换新鲜的培养液。 方法2：

（1）将水浴锅预热至37℃

（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 （3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等。（4） 戴好眼睛和手套，根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编

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号。

（5）从液氮罐中取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

（6）迅速解冻：①迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。②约1～2min后冻存管内液体完全溶解，取出用75%酒精纱布擦拭冻存管的外壁，移入超净台内操作。③可将融化的冻存细胞加入10ml10%小牛血清 1640培养基中，并移入50ml锥形离心管中，离心1500r/min 5min ④弃上清液。⑤轻叩管底，使细胞松散，向离心管内准确加入10ml无血清RPMI-1640培养液，制成细胞悬液。取100μl左右体积的细胞悬液后，立即在加入的无血清培养基中添加小牛血清，使成10%小牛血清 RPMI-1640培养基重悬的细胞悬液。

(7)细胞计数和培养细胞：

取100μl体积的细胞，行台盼蓝拒染计数，将细胞悬液分装入培养瓶内，活细胞终密度5×105/ml，将培养瓶（旋松瓶口）放入37℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养， 换液的时间根据细胞种类、倍增时间等情况而定（见各细胞株细胞的复苏，冻存和传代操作规程）。 注：

1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml和不能高于1χ106/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中，重新取样计数；如果细胞数目很多要进行再次稀释后取样重新计数。细胞浓度以5×105/ml为宜。

2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。（有关细胞计数的详细内容见附件6.细胞计数操作流程）

6.水浴锅预热至37℃。

7.水浴锅冻存管不超过2支，避免融化时间延长。

8.一次只复苏一种细胞，防止复苏多种细胞造成细胞交叉污染。 9.将培养瓶放入培养箱，拧松瓶盖1/4圈，以便气体交换。

10. 血清中含有胰蛋白酶的抑制剂。因此在胰蛋白酶消化前，用PBS处理的时候，去除痕量的血清非常重要。

11.胰蛋白酶的孵育时间和分散细胞成为单细胞悬液使用的浓度根据不同的细胞株也有所不同。有必要调整这些参数来适应所培养的细胞（按各细胞株细胞的复苏，冻存和传代操作规程执行）。

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12.不要待细胞长得太满的时候才传代，因为细胞由于接触抑制和堆积 的代谢产物的毒副作用，会慢慢的老化。

13.传代的时候细胞不要太少，等长到需要传代时，细胞变老，尤其贴 壁细胞太少很难长不到80%，等长到80%左右时候，细胞会变得老化。 14.细胞传代时，细胞一定均匀分散，尤其是贴壁生长的细胞，不然很容易出现部分地方很密，其他部分细胞却很稀，长密地方的细胞代谢产物和死细胞都会很多，不仅不利于细胞总数的增加，还会影响那些长得比较稀的地方的细胞的正常生长。

15.刚传代的细胞，当天不要老拿出来看，看得太频繁，会因为培养液的晃动和孵箱内外的温度和CO2浓度的变化，而影响细胞的生长，尤其影响贴壁细胞的贴壁，这在刚复苏的细胞、或者那些比较脆弱的细胞影响尤为明显。

五、细胞的指数生长期

细胞的指数生长期是指细胞在一定的环境下经过了短暂的适应期，进而进入快速生长期，即以2的N次方的速度生长(N为细胞的分裂次数)的细胞，此期的细胞为指数或对数生长期细胞。即原来只有一个细胞，进入对数期以后就会变为两个，在对数期生长速率远远大于死亡速率，所以在对数期最显著地特征就是细胞的数目大量增加。但当细胞经过一定时间的生长会消耗掉营养物质，产生大量的次生代谢产物使得pH值下降，此时生长速度下降，生长速率和死亡速率平衡，细胞的总个数基本保持不变，细胞的对数生长期结束进入平台期。可以用细胞生长曲线法确定处于指数生长期的细胞。 1.细胞计数绘制细胞生长曲线法

细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增殖数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为：在同一规格的培养瓶中， 接种等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数的对数为纵坐标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反映出细胞生长的动态。

测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养1周（7天），期间逐日检测一组，计数细胞数量，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。（具体方法见附件）。 2.MTT法绘制细胞生长曲线法

细胞生长曲线可采用MTT法来进行（具体操作方法见附件）。标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。

第四部分 细胞模型建立的质控

一、细胞模型稳定性

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